论文部分内容阅读
目的阐明健脾补肾、清肠化湿方促进MSCs归巢从而调节溃疡性结肠炎免疫功能、重建肠黏膜屏障的作用机制。方法体外实验：分离培养大鼠骨髓来源的MSCs,取分离培养的第3代细胞,随机分为空白组、不同浓度(0.390625 ug/ml～50ug/ml)的健脾补肾、清肠化湿方组,采用C CK-8法检测各组细胞增殖情况,并确定后续实验浓度：后续试验分为空白组,健脾补肾、清肠化湿方低、中、高剂量组(0.39ug/ml,0.78ug/ml和1.56ug/ml),采用Transwell法检测各组细胞迁移情况,另设复方各剂量联合细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)抑制剂U0126作为对照,Western Blot法检测ERK和环磷腺苷效应元件结合蛋白(CAMP-response element binding protein,CREB)蛋白表达水平。采用LPS预处理诱导MSC s炎症模型,分别予以黄芪甲苷、黄芩苷及其配伍干预,采用MTT法观察细胞增殖能力,镜下观察细胞分化能力,流式细胞术观察细胞周期情况,膜联蛋白-V流式术观察药物对MSCs凋亡的影响,并采用Elisa、RT-PCR和Western Blot分别检测炎症因子IL-1β、IL-8和TNF-α水平及与ERK通路的关系。体内实验：体外培养的MSCs细胞悬液加入0.78ug/ml健脾补肾、清肠化湿方共孵育,并以4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)荧光标记备用。采用TNBS法制备大鼠UC模型,分为空白组、模型组、MSCs组、干预MSCs组和联合组。空白组、模型组大鼠尾静脉分别注入1ml生理盐水,MSCs组大鼠尾静脉注入lml MSCs (1×106个),干预MSCs和联合组大鼠分别经尾静脉注入体外中药干预的MSCs (1×106个),联合组再予健脾补肾、清肠化湿方13.6g.kg-1连续灌胃10 d。每组分别于第5天、第10天各处死5只,对大鼠结肠标本予以大体形态和组织学评估,电子显微镜观察结肠组织病理学和杯状细胞生成情况,共聚焦显微镜观察DAPI标记MSCs在结肠内归巢情况,免疫组化检测肠干细胞标记物Musashi-1的表达,Western Blot法检测肠干细胞标记物Lgr5和Ephrin-B3的蛋白表达水平,ELISA法检测各组大鼠结肠组织IL-6、IL-17和TGF-β水平,RT-PCR和Western Blot法分别检测大鼠结肠组织Muc2 mRNA和蛋白的表达,Western Blot法检测E-cadherin及MATH1和KLF-4蛋白的表达水平。结果体外实验：和空白组相比,健脾补肾、清肠化湿方在一定浓度范围内(0.39ug/ml～ 1.56ug/ml)可促进MSCs的增殖,0.78ug/ml和1.56 ug/ml浓度组优于空白组(P<0.01),当复方浓度升高至3.125ug/ml时则未见明显促增殖作用(P>0.05)。0.39ug/ml、0.78ug/ml和1.56ug/ml浓度组均可促进MSCs迁移,并升高ERK和CREB蛋白磷酸化水平(P<0.05),且能被U0126抑制。100ng/ml浓度的黄芪甲苷和黄芩苷药物对MSCs促增殖效果最明显,配伍组效果最佳,其次为黄芪甲苷组,且处理48小时优于24小时；各组药物均能促进细胞生长和向上皮细胞分化,减少细胞凋亡,配伍组凋亡明显减少。黄芪甲苷、黄芩苷均能下调LPS诱导的MSCs炎症模型IL-1β、IL-8和]NF-α水平,配伍组效果最佳,且与配伍组相比,ERK抑制剂组能够回补炎症效应。体内实验：经移植及灌胃治疗后,除模型组和正常组外,各移植组结肠组织均能检测到DAPI标记的MSCs,且数量随时间的延长而逐渐增加；各移植组均能改善UC模型结肠组织大体形态和结肠组织病理学,促进肠杯状细胞生成,随着时间的延长,联合组效果最佳。第5天,与模型组比较,各移植组均可见Musashi-1阳性表达,联合组有显著差异(P<0.01)；各移植组均能改善结肠组织IL-6水平,同时联合组能降低IL-17水平和升高TGF-β水平(P<0.05),且改善IL-6和TGF-β方面优于MSCs组(P<0.05)；各移植组均能升高结肠组织Muc2 mRNA水平,其中干预MSCs组和联合组明显升高(P<0.01),且优于MSCs组(P<0.05)。第10天,各移植组Musashi-1表达均明显优于模型组(P<0.01),且联合组、干预MSCs组优于MSCs组(P<0.05)；联合组能升高结肠组织Lgr5和Ephrin-B3蛋白水平,优于MSCs组(P<0.05),干预MSCs组能升高Ephrin-B3蛋白水平(P<0.01),优于组MSCs组(P<0.05)：联合组能明显改善IL-6和TGF-β水平(P<0.01),优于MSCs组(P<0.01)；干预MSCs组能明显改善IL-17、TGF-p水平(P<0.01),降低IL-6方水平(P<0.05),但与MSCs组相比,差异无统计学意义(P>0.05)；联合组能升高Muc2mRNA和蛋白表达水平(P<0.05),明显升高E-cadherin和MATH1蛋白水平(P<0.01),优于MSCs组(P<0.05),干预MSCs组也能升高E-cadherin和MATH1蛋白水平(P<0.01),在改善MATH1方面优于MSCs组(P<0.05)。结论健脾补肾、清肠化湿方在一定浓度范围内可促进大鼠骨髓MSCs体外增殖和迁移,并能提高ERK和CREB蛋白表达,推测其促增值迁移可能与ERK/CREB通路有关；健脾补肾、清肠化湿方可以促进移植的MSCs向UC模型大鼠受损肠组织归巢,促进其向肠干细胞分化,减轻肠道炎症反应,修复受损黏膜,且移植的同时配合灌胃治疗效果更佳。黄芪甲苷和黄芩苷体外能促进MSCs增值生长,抑制凋亡,促进其向上皮细胞分化,下调炎症因子表达,两药配伍效果更明显,为中医药临床治疗溃疡性结肠炎提供科学依据。