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目的:黑色素瘤是一种高度恶性的肿瘤,是一个多因素和多阶段的复杂疾病,应用单一手段的治疗往往不能达到理想的抑瘤效果。因此,针对其发生发展的机制,将现有的治疗方法进行改良及联合,寻找更为有效的治疗方法,是黑色素瘤治疗的前景。目前,针对免疫检查点PD-1的单克隆抗体治疗黑色素瘤已经取得了一定成功,但患者响应率仍然需要提高。前期研究发现,PD-1-si RNA能够通过抑制PD-1的表达治疗小鼠黑色素瘤,但由于其治疗效率仍然需要提高,因此增强其治疗效率和与其他药物联合应用可为抗黑色素瘤治疗提供新思路。Cp G ODN（富含鸟嘌呤和胞嘧啶的寡聚核苷酸）作为人工合成的含Cp G基序的脱氧寡核苷酸单链DNA,能够激活机体的NK细胞和B细胞,刺激脾细胞和浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells,p DC）,并且刺激干扰素的分泌,展现出强效的免疫刺激功能,具有明显的临床应用前景。本研究将Cp G ODN和由减毒沙门氏菌携带的靶向PD-1的si RNA联合应用,治疗小鼠黑色素瘤,并探讨潜在的抗肿瘤机制。同时,考虑到新药开发是一个成本极高的过程,并且存在耗时长且有极大失败风险的劣势。因此,本论文应用临床上一个抗焦虑药物——盐酸丁螺环酮,探索其在抗黑色素瘤中的新功能以及其与PD-1-si RNA联合抗黑色素瘤作用。研究方法:1、菌落铺板方法检测减毒沙门氏菌的肿瘤靶向性以及其在其它器官的分布。2、建模、分组和治疗:实验用鼠为6-8周雌性C57BL/6小鼠。将含有1×10~6个小鼠黑色素瘤细胞（B16-f0）的细胞悬液皮下注射到每只小鼠的右后腿根部。若观察到局部隆起,则表明接种成功。将荷瘤小鼠随机分为5组:PBS组、Scramble组（注射随机的si RNA序列）、PD-1-si RNA组、Cp G-ODN组和Cp G-ODN+PD-1-si RNA组。治疗方案如下:PBS组的每只小鼠瘤内注射100μl PBS;Scramble组的每只小鼠瘤内注射100μl携带有Scramble序列的减毒沙门氏菌（4×10~5CFU）;PD-1-si RNA组中的每只小鼠瘤内注射100μl携带PD-1-si RNA的减毒沙门氏菌（4×10~5 CFU）;Cp G-ODN组中的每只小鼠接受腹股沟淋巴结注射20μg Cp G-ODN;联合治疗组Cp G-ODN+PD-1-si RNA组的每只小鼠瘤内注射100μl携带PD-1-si RNA的减毒沙门氏菌（4×10~5 CFU）,同时接受腹股沟淋巴结注射20μg Cp G-ODN。用药频次:Cp G ODN隔天给药一次,共给药四次;减毒沙门氏菌治疗（携带Scramble序列或PD-1-si RNA序列）一共给药两次,分别在开始治疗的第一天和第七天。3、Cp G-ODN+PD-1-si RNA联合治疗对荷瘤小鼠的治疗效果检测:通过分析不同组的瘤重及生存期判断治疗效果。用生化指标检测给药后是否会对小鼠产生明显的副作用。4、探索Cp G-ODN+PD-1-si RNA联合疗法抗肿瘤机制:用Western blotting检测与细胞周期（cyclin D1）、增殖（Stat3,p-Stat3）、凋亡（cleaved caspase 3）、迁移（MMP-2）以及细胞免疫（CD4、CD8和PD-1）有关的蛋白表达;用TUNEL方法原位检测各组肿瘤细胞凋亡情况;用免疫组化方法检测CD4、CD8和PD-1蛋白的表达;用免疫荧光方法检测细胞增殖标志性蛋白（Ki67）及巨噬细胞标志性蛋白（CD86和CD11b）的表达;用流式细胞术的方法检测脾脏淋巴细胞和NK细胞的数量变化;用NK细胞杀伤实验检测给药后NK细胞的杀伤能力;用T细胞增殖实验检测给药后的T细胞的增殖能力;用ELISA实验检测Cp G-ODN+PD-1-si RNA联合疗法的抗肿瘤效应所涉及的细胞因子。5.通过CCK8实验、细胞划痕实验以及Western blot检测盐酸丁螺环酮对黑色素瘤细胞的作用。6.建立黑色素荷瘤小鼠,分为PBS组、盐酸丁螺环酮（Buspirone Hydrochloride,Bh）组、PD-1-si RNA组和PD-1-si RNA+Bh组。PD-1-si RNA组中的每只小鼠瘤内注射携带4×10~5CFU的运载PD-1-si RNA的减毒沙门氏菌;Buspirone Hydrochloride组瘤内注射200μg的盐酸丁螺环酮;Cp G-ODN+Bh联合治疗组分别给予减毒沙门氏菌以及盐酸丁螺环酮。用药频次:盐酸丁螺环酮每天给药一次,共给药7次;运载PD-1-si RNA的减毒沙门氏菌一共给药两次,分别在开始治疗的第一天和第七天。检测各组小鼠的肿瘤大小以及组织中相关蛋白表达的影响。7、统计学分析:计量资料的结果用±SD表示。采用SPSS19.0统计学软件（SPSS,Inc.,Chicago,IL,USA）进行分析。采用单因素方差分析（ANOVA）检验各组数据间的差异,采用Kaplan-Meier法分析生存率。P＜0.05被认为是具有统计学意义的差异。结果:1、经检测,在注射减毒沙门氏菌24h后,减毒沙门氏菌主要分布在肿瘤组织中,这表明减毒沙门氏菌的靶向性较好。2、对不同组荷瘤小鼠执行各自的治疗方案后,Cp G-ODN+PD-1-si RNA联合治疗组荷瘤小鼠的肿瘤最轻并且Cp G-ODN+PD-1-si RNA联合治疗组荷瘤小鼠的生存期最长。3、对不同组小鼠执行各自的治疗方案后,各组小鼠之间的生化指标无明显差异,即Cp G-ODN+PD-1-si RNA联合疗法并未导致小鼠出现明显副作用。4、通过Western blotting方法发现,与对照组相比,Cp G-ODN+PD-1-si RNA联合治疗组的p-Stat3、Cyclin D1和MMP2的蛋白表达水平减弱,cleaved caspase 3的表达水平增强。这表明Cp G-ODN+PD-1-si RNA联合疗法的抗肿瘤机制可能与细胞增殖（Stat3）、细胞周期（Cyclin D1）、细胞迁移（MMP-2）及细胞凋亡（cleaved caspase 3）有关。5、通过免疫荧光方法发现,与对照组相比,Cp G-ODN+PD-1-si RNA联合治疗组肿瘤组织中的细胞增殖相关蛋白（Ki67）表达水平显著降低。TUNEL结果也表明,与对照组相比,Cp G-ODN+PD-1-si RNA联合治疗组肿瘤组织中的凋亡细胞明显增多。这进一步证明了Cp G-ODN+PD-1-si RNA联合疗法在一定程度上能抑制肿瘤增殖,并且促进肿瘤凋亡。6、通过免疫组化方法发现,Cp G-ODN+PD-1-si RNA联合治疗组的肿瘤组织中CD4、CD8表达水平与对照组相比显著增加,而PD-1的表达水平则显著降低。通过Western blotting方法也发现了相同的趋势。这表明Cp G-ODN+PD-1-si RNA联合疗法的抗肿瘤机制可能与肿瘤组织中CD4+、CD8+T细胞浸润增加及PD-1在T细胞表面的表达减少有关。7、通过流式细胞术发现,与对照组相比,Cp G-ODN+PD-1-si RNA联合治疗组的脾脏中CD4+、CD8+T细胞和NK细胞的数量明显增加。这表明Cp G-ODN+PD-1-si RNA联合疗法能够在一定程度上促进抗肿瘤免疫,从而抑制肿瘤的生长。8、通过免疫细胞功能检测实验发现,与对照组相比,Cp G-ODN+PD-1-si RNA联合治疗组的T细胞增殖能力和NK细胞的杀伤能力比未治疗组均有一定的提升;这表明Cp G-ODN+PD-1-si RNA联合疗法的抗肿瘤机制不仅与T细胞和NK细胞的数量增加有关,而且还在一定程度上与T细胞和NK细胞功能的提高有关。9、通过ELISA方法发现,与对照组相比,Cp G-ODN+PD-1-si RNA联合治疗组的血清中TNF-α和IL-6的浓度显著升高。这表明细胞因子TNF-α与IL-6在Cp G-ODN+PD-1-si RNA联合疗法的抗肿瘤中可能发挥着一定作用。10、通过免疫荧光发现,与对照组相比,Cp G-ODN+PD-1-si RNA联合治疗组肿瘤组织中的CD11b+CD86+的巨噬细胞数量显著升高。这表明Cp G-ODN+PD-1-si RNA联合疗法的抗肿瘤机制可能与M1型巨噬细胞浸润增加相关。11、盐酸丁螺环酮对黑色素瘤细胞具有一定的杀伤作用。12、盐酸丁螺环酮在一定程度上抑制了黑色素瘤细胞的迁移。13、盐酸丁螺环酮在一定程度上抑制了黑色素瘤细胞中p-Stat3、MMP2、cyclin D1蛋白的表达。14、盐酸丁螺环酮联合减毒沙门氏菌运载的PD-1-si RNA在一定程度上抑制了小鼠黑色素瘤的生长以及肿瘤组织中p-Stat3、MMP2、cyclin D1蛋白的表达。结论:1、与模型组及单独治疗组相比,联合应用Cp G ODN及PD-1-si RNA更能够有效地抑制小鼠黑色素瘤的生长,增加荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫反应。2、Cp G-ODN+PD-1-si RNA联合治疗的抑瘤机制可能是由于减毒沙门氏菌对肿瘤的靶向定位及杀伤,PD-1通路被阻断从而导致抑制的T细胞杀伤功能被解除以及Cp G ODN介导的免疫增强,从而发挥出更强大的抑制肿瘤细胞增殖及促进肿瘤细胞凋亡的作用。3、Cp G-ODN+PD-1-si RNA联合治疗不仅增强了肿瘤微环境中的免疫反应,也在一定程度上提高了小鼠的整体免疫水平。4、盐酸丁螺环酮能够抑制黑色素瘤细胞增殖及迁移,显示出一定的抗黑色素瘤潜力。盐酸丁螺环酮与PD-1-si RNA联合应用显示出一定的协同抑制肿瘤生长的作用。