随着世界人口进入老龄化的速度加快,脑卒中(缺血性脑血管病)的发病率逐年升高,现已成为威胁人类生命的最主要疾病之一。因脑卒中具有发病率高、致残率高和死亡率高的特点,给个人、家庭和社会带来巨大的精神压力和经济负担。虽然尽早溶栓治疗通过恢复脑血氧供应能保护神经元,但是缺血后再灌注往往也会加重脑组织的损伤(再灌注损伤),导致神经元坏死。因此,研究缺血诱导脑损伤的病理生理机制,寻找有效的治疗靶点,对提高脑卒中患者的治愈率具有重要意义。缺血再灌注诱导脑损伤主要与谷氨酸兴奋性毒作用、胞内钙(intracellular Ca2+concentration,[Ca2+]i)超载、自由基与一氧化氮的损伤、脑水肿等病理机制有关。其中,谷氨酸兴奋性毒作用被认为是脑缺血诱导神经元死亡的重要机制。然而,临床资料显示阻断谷氨酸受体对脑卒中并未能取得理想的疗效。因此,探究非谷氨酸依赖性钙离子超载诱导的神经元损伤机制将非常有意义。瞬时感受器电位(transient receptor potential, TRP)受体家族是一类重要的非选择性阳离子通道。瞬时感受器电位香草素受体亚家族Ⅳ型(TRP vanilloid4, TRPV4)在中枢神经系统广泛分布,主要表达在海马、大脑皮层、丘脑、小脑等脑区。TRPV4受体作为一种以钙离子为主的阳离子通道,被激活后能引起以Ca2+为主的内向电流。近年来,越来越多的研究报道了TRP受体家族成员参与脑缺血再灌注损伤的病理过程。TRP家族中的nelastati家族Ⅱ型、Ⅶ型和canonical家族Ⅵ型等成员已被报道介导了脑缺血引起的神经元死亡。TRPV4受体自发现以来,因其可被低渗、温热、机械、花生四烯酸及其代谢物等多种刺激激活而越来越受到人们关注。脑缺血时,由于能量代谢障碍所引起的细胞水肿可以通过改变细胞膜机械张力激活TRPV4受体；能量代谢障碍所产生的大量花生四烯酸也可以通过其代谢产物5,6-环氧二十碳三烯甘油酸等激活TRPV4受体。提示缺血再灌注引起脑损伤的病理过程有可能与TRPV4受体的激活有关。阻断TRPV4受体可以减轻氧化应激对海马星形胶质细胞的损伤,对氧糖剥夺导致的海马CA1神经元损伤也具有保护作用,提示阻断TRPV4受体有可能减轻缺血导致的脑损伤。我们前期在初级感觉神经元上的研究发现,TRPV4受体激活后通过影响其下游的信号通路(PKA、PKC、PKG等)调节细胞膜上的电压依赖性离子通道和TRPV1受体的功能,提高神经元的兴奋性。在视网膜神经节细胞上的研究发现TRPV4受体激动剂能够剂量依赖性增加[Ca2+]i,提高细胞的兴奋性,诱导细胞凋亡。此外,激活TRPV4受体能够增加培养的海马神经元之间的微小兴奋性突触后电流的频率,提示脑缺血再灌注通过激活TRPV4受体有可能促进谷氨酸的释放。因此,本课题将通过在体实验首先明确TRPV4受体是否参与脑缺血再灌注损伤的病理过程,然后重点研究阻断TRPV4受体对脑缺血再灌注损伤是否有保护作用及其分子机制,为今后预防和治疗脑缺血再灌注损伤提供新的靶点和思路。研究目的1.明确TRPV4受体是否参与脑缺血再灌注诱导的损伤；2.阐明阻断TRPV4受体保护脑缺血再灌注损伤的分子机制。第一部分TRPV4受体在脑缺血再灌注损伤中的作用材料与方法1.脑缺血再灌注小鼠模型制备：用鱼线阻塞右侧大脑中动脉60min,制备大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)再灌注小鼠模型。2.实时定量RT-PCR和Western blot:MCAO再灌注后不同时间点取出海马组织提取mRNA和蛋白,检测TRPV4受体的nRNA和蛋白水平。3.TTC染色：MCAO再灌注24h的脑组织,冠状切片后置TTC溶液中反应,正常脑组织呈红色而梗死组织呈白色,白色脑组织体积即为MCAO再灌注后梗死体积。4.甲苯胺蓝染色：脑组织用多聚甲醛固定后石蜡包埋切片,用甲苯胺蓝染色,进行海马CA1锥体神经细胞的计数。结果1. MCAO再灌注后2-72hTRPV4受体的mRNA的表达增加；MCAO再灌注4-48hTRPV4受体蛋白水平增加,MCAO再灌注后18hTRPV4受体蛋白水平达到峰值,之后逐渐下降,MCAO再灌注后72h恢复到正常水平。2.侧脑室给予TRPV4受体特异性阻断剂HC-067047,在0.1-30μM/2μL/只的剂量范围内,能够浓度依赖性地减小MCAO再灌注后24h脑梗死的体积；HC-067047(10μM/2μL/只)对脑缺血再灌注损伤神经保护作用的有效时间窗长达12h。侧脑室给予TRPV4受体非特异性阻断剂钌红也能够有效减小MCAO再灌注后24h脑梗死的体积。3.与对照组小鼠相比,侧脑室注射TRPV4受体激动剂4a-PDD能够引起海马CA1神经元的死亡。结论脑缺血再灌注后4-48h海马TRPV4受体表达明显增加。阻断TRPV4受体对脑缺血再灌注损伤有保护作用。第二部分阻断TRPV4受体保护脑缺血再灌注损伤的分子机制研究材料与方法1.脑缺血再灌注损伤的细胞模型建立：脑缺血时,由于能量代谢障碍会引起脑水肿。我们的前期研究已证明,细胞水肿可以激活TRPV4受体。为了研究脑缺血后细胞水肿激活TRPV4受体导致细胞死亡的机制,本研究采用将细胞外液渗透压降低到240mOsm/kg(低渗刺激)模拟脑水肿细胞模型。2.场电位记录：制备海马冠状切片,检测海马Schaffer支-CA1突触的兴奋性突触后电位(excitatory post-synaptic potentiation, EPSP)和双脉冲易化(paired-pulse facilitation, PPF)。3.全细胞膜片钳记录：制备海马冠状切片,检测脑片海马CA1锥体神经元微小兴奋性突触后电流(miniature excitatory postsynaptic current, mEPSC)、NMDA受体介导的电流(NMDA-indcued current,INMDA)和海马突触前锥体神经元高电压激活钙电流(high voltage-gated calcium current,Ica)。4.甲苯胺蓝染色：同第一部分。结果1.场电位记录结果显示,TRPV4受体激动齐4α-PDD进行海马脑片灌流能引起海马Schaffer侧支-CA1突触EPSP的斜率增加伴有PPF的比值降低,提示TRPV4受体活化能增加突触前神经递质的释放。当降低海马脑片细胞外灌流液的渗透压到240mOsm/kg(低渗刺激),海马Schaffer侧支-CA1突触EPSP斜率显著增加,而PPF的比值降低。TRPV4受体阻断剂(HC-067047)能够阻断低渗突触前神经递质的释放。2.全细胞膜片钳记录结果显示,低渗增加海马脑片CA1锥体细胞mEPSC的频率和幅度,提示低渗刺激不仅能增加突触前神经递质的释放,还能增加突触后膜谷氨酸受体的活性。3.低渗刺激对海马CA1突触前锥体神经元的电压门控性钙电流(Ica)的幅度、电流—电压曲线、激活曲线和失活曲线无明显作用。给予N型或P/Q型电压门控性钙通道阻断剂不能影响低渗刺激增加EPSP斜率。4. TRPV4受体激动剂4a-PDD能增加海马CA1锥体神经元INMDA的幅度。同样低渗刺激也能增加海马CA1锥体神经元INMDA的幅度。低渗刺激增加TMDA受体活性的作用能完全被TRPV4受体阻断剂HC-067047所阻断,提示低渗刺激通过激活TRPV4受体能增强谷氨酸NMDA受体功能活性。5.与]TRPV4受体激动剂4α-PDD的作用相同,低渗刺激能够增加INMDA量效曲线中的最大反应能力,但对ECso值无明显影响,并对INMDA电流的I-V曲线无明显作用,提示低渗刺激激活TRPV4受体能增强谷氨酸INMDA受体离子通道的开放。6.NR2B亚基特异性阻断剂ifenprodil能有效阻断低渗刺激对INMDA的增强作用,而NR2A亚基阻断剂NVP-AAM007对低渗刺激的作用无明显影响。CaMKII的阻断剂能够阻断低渗刺激对INMDA的增强作用。PKC和CKII的阻断剂对低渗刺激的作用无影响。7. NMDA受体阻断剂MK801能减轻TRPV4受体过激活诱导海马CA1神经元的损伤。结论缺血再灌注后TRPV4受体过表达和脑水肿增强TRPV4受体活性能增加TRPV4受体的钙离子内流,以促进谷氨酸的释放,同时激活CaMKII通过提高NR2B亚基磷酸化水平增加NMDA受体的钙内流。结果提示缺血再灌注后TRPV4受体功能增加可以引起钙超载,激活细胞凋亡信号通路,进而造成神经元死亡。因此,本研究提出阻断TRPV4受体对脑缺血再灌注损伤有保护作用。