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鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）,是鸡慢性呼吸道病（Chronic respiratory disease,CRD）的主要病原菌。CRD在世界各地的鸡群中普遍存在,迄今仍未找到有效的防控措施,给家禽业造成了巨大的经济损失,因此深入探究MG感染的致病机制对CRD的防控具有重要的科学意义。课题组前期的研究主要针对miRNA-mRNA相互作用网络对MG感染的调控机制。近年来研究表明,miRNA的调控网络非常复杂,Lnc RNA可以作为一种竞争性内源RNA（competing endogenous RNAs,ce RNA）充当miRNA的海绵介导miRNA-mRNA的调控,且miRNA-mRNA受到转录因子（Transcription factor,TF）的调控。课题组前期深度测序发现,miR-33-5p在MG感染后显著上调,因此,本研究通过生物信息学分析和试验确证miR-33-5p在MG感染过程中Lnc RNA-miRNA-mRNA以及TF-miRNA的复杂调控网络,旨在揭示miR-33-5p在MG感染过程中的作用及其分子机制,对阐明MG感染的致病机制及诊断防控均具有重大的科学意义。主要研究结果如下:1.构建MG感染的鸡胚模型和细胞模型,qPCR结果表明:miR-33-5p在MG感染的鸡胚肺组织及细胞中的表达量均显著上调（p＜0.05）。Western blot结果显示:与miR-33-5p-NC（MG）组相比,miR-33-5p的过表达能够显著抑制DF-1细胞中鸡毒支原体粘附蛋白（pMGA1.2）的表达,而抑制miR-33-5p能显著促进pMGA1.2的表达,说明miR-33-5p通过抑制pMGA1.2的表达来抑制MG与DF-1细胞的黏附作用。2.qPCR和Elisa检测结果显示,超表达miR-33-5p显著下调MG诱导的TNF-α和IL-1βmRNA（p＜0.05）和蛋白的表达量;抑制miR-33-5p显著促进TNF-α和IL-1β的表达（p＜0.05）。CCK-8和凋亡试剂盒检测结果表明,miR-33-5p可以促进MG感染的DF-1细胞增殖,抑制MG感染的细胞凋亡。qPCR和Western blot检测发现,miR-33-5p可以显著抑制MG诱导的促凋亡基因FAS、CASP3、CASP8和CASP9的表达（p＜0.05）,显著上调抗凋亡基因BCL-2的表达（p＜0.05）。以上结果表明miR-33-5p可以显著抑制MG诱导的炎症反应,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡从而抵抗MG的感染。3.生物学软件预测JNK1是miR-33-5p的靶基因。qPCR和Western blot分析表明,MG感染的鸡胚肺组织和细胞中JNK1的表达水平明显降低（p＜0.05）,与miR-33-5p的表达呈相反的趋势;双荧光素酶结果显示,JNK1-3’UTR可以与miR-33-5p的种子序列直接结合;qPCR及Western blot结果显示,过表达miR-33-5p显著降低JNK1 mRNA和蛋白的表达水平（p＜0.05）,而抑制miR-33-5p后呈相反的结果。以上结果表明JNK1是miR-33-5p的直接靶基因,其表达受到miR-33-5p的负向调节。4.进一步探究miR-33-5p对JNK信号通路基因的调控作用。qPCR和Western blot检测显示,与miR-33-5p-NC组相比,超表达miR-33-5p显著抑制JUN和FOS的mRNA和蛋白磷酸化水平（p＜0.05）;抑制miR-33-5p后呈相反的结果。超表达JNK1能显著促进JUN和FOS的mRNA和蛋白磷酸化水平（p＜0.05）;超表达JNK1和miR-33-5p共转染可削弱JNK1的超表达效果。转染JNK1特异性抑制剂SP600125后呈相反结果。以上结果说明miR-33-5p通过靶向JNK1抑制JNK信号通路在MG感染中起作用。5.Elisa、qPCR和Western blot结果显示,超表达JNK1显著上调pMGA1.2、TNF-α和IL-1β的表达水平（p＜0.05）;超表达JNK1和miR-33-5p共转染则显著抑制了JNK1过表达导致的促炎因子和pMGA1.2的增加（p＜0.05）。CCK-8和凋亡试剂盒检测发现,JNK1可以显著抑制MG感染的细胞增殖（p＜0.05）,促进MG感染的细胞凋亡（p＜0.05）,显著上调MG诱导的促凋亡基因FAS、CASP3、CASP8和CASP9的表达（p＜0.05）,极显著下调抗凋亡基因BCL-2的表达（p＜0.01）;而超表达JNK1和miR-33-5p共转染显著抑制了JNK1介导的细胞增殖减少和细胞凋亡增加（p＜0.05）。抑制JNK1后结果相反。以上结果表明miR-33-5p通过靶向JNK1促进细胞增殖,抑制MG诱导的炎症反应和细胞凋亡,抑制MG增殖。6.qPCR结果显示:与未感染细胞相比,MG感染DF-1细胞中miR-33-5p的初级转录本（pri-miR-33-5p）和前体（pre-miR-33-5p）的相对表达量均极显著上调（p＜0.01）,与MG诱导的成熟miR-33-5p的表达趋势相吻合,表明MG在转录水平上调控miR-33-5p的表达。双荧光素酶报告系统结果表明,miR-33-5p的核心启动子区域在转录起始位点上游951-863bp;STAT5特异性结合miR-33-5p的启动子区域,并在MG感染过程中增强miR-33-5p的转录活性,说明STAT5是miR-33-5p的关键转录调控因子。进一步试验验证,qPCR及Western blot结果显示,STAT5在MG感染中极显著上调（p＜0.01）,过表达STAT5能极显著提高miR-33-5p的表达（p＜0.01）,极显著降低靶基因JNK1的表达（p＜0.01）。综上所述,在MG感染中,STAT5为miR-33-5p的关键转录调控因子,在转录水平上通过促进miR-33-5p的转录活性,上调了miR-33-5p表达进而降低了JNK1的表达。7.qPCR结果显示,Lnc90386在MG感染的鸡胚肺组织及细胞中的表达量均显著下调（p＜0.05）。生物学软件预测和qPCR结果表明,Lnc90386不具有编码能力,且主要表达于细胞质。双荧光素酶报告基因结果表明,Lnc90386与JNK1竞争性结合miR-33-5p。qPCR和Western blot结果显示,Lnc90386通过上调miR-33-5p进而降低JNK1的表达。以上结果表明,Lnc90386通过与JNK1竞争结合miR-33-5p,阻碍miR-33-5p对JNK1的靶向作用。8.进一步检测Lnc90386-miR-33-5p-JNK1在MG感染中的调节作用。qPCR,Elisa和Western blot结果显示,超表达Lnc90386显著上调pMGA1.2、TNF-α和IL-1β的表达水平（p＜0.05）;超表达Lnc90386与miR-33-5p共转染则抑制了Lnc90386过表达导致的促炎因子和pMGA1.2的增加（p＜0.05）。CCK-8和凋亡试剂盒检测结果表明,Lnc90386对MG感染的细胞增殖有显著的抑制作用（p＜0.05）,并能显著促进MG诱导的细胞凋亡（p＜0.05）,显著上调MG诱导的促凋亡基因FAS、CASP3、CASP8和CASP9的表达（p＜0.05）,下调抗凋亡基因BCL-2的表达（p＜0.05）;而超表达Lnc90386和miR-33-5p共转染显著抑制了Lnc90386介导的细胞增殖减少和细胞凋亡增加。抑制Lnc90386后结果相反。以上结果表明,下调表达的Lnc90386通过靶向miR-33-5p抑制JNK1的表达,抑制MG增殖和MG诱导的炎症反应,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡来抵御MG感染。综合以上结果揭示Lnc90386通过ce RNA充当miR-33-5p的海绵介导miR-33-5p-JNK1的调控,STAT5是miR-33-5p的关键转录调控因子。在MG感染过程中,miR-33-5p通过Lnc90386-miR-33-5p-JNK1及STAT5-miR-33-5p-JNK1的共同调控,通过抑制JNK1/JUN/FOS的信号通路抵抗MG感染。抑制JNK1/JUN/FOS信号通路,抑制机体的炎症反应,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡从而抵抗MG感染。