蛋白质翻译后修饰作为蛋白质功能调节的重要方式,在细胞的生命过程中发挥着重要的作用。本文采取多种研究手段,对两种研究翻译后修饰的工具——遗传密码扩展技术（Genetic code expansion）和Lbpro*的性质进行了探究。遗传密码拓展技术利用正交化的氨酰-tRNA合成酶/tRNA对,可以在蛋白质的特定位点引入具备特殊功能的非天然氨基酸,在蛋白质翻译后修饰的研究中展现出了巨大的应用潜力。然而,正交化氨酰-tRNA合成酶/tRNA对,特别是具备相互正交性氨酰-tRNA合成酶/tRNA对的数量较少,这极大地限制了遗传密码扩展技术在生物学研究中的应用。本实验室利用蛋白质嵌合技术,构建了在大肠杆菌和哺乳动物细胞中均正交的嵌合苯丙氨酸系统,并利用这个系统引入了多个非天然氨基酸。然而,这个系统与应用广泛的Mj.酪氨酸翻译系统、Ma.吡咯赖氨酸翻译系统的相互正交性还有待验证。本文利用嵌合苯丙氨酸翻译系统和Ma.或Mj.翻译系统在GFP的不同位置引入对应的非天然氨基酸,通过荧光检测、免疫印迹与LC-MS等实验方法,验证了这两个双系统的活性和特异性,证明了嵌合苯丙氨酸翻译系统与Ma.翻译系统、Mj.翻译系统之间的相互正交性,增加了可用于遗传密码扩展技术的氨酰-tRNA合成酶/RNA对种类,进而拓宽了该技术在蛋白质翻译后修饰研究中的应用。Lbpro*是一种包含L102W突变的口蹄疫病毒编码的蛋白酶,利用Lbpro*处理细胞裂解液,可以将细胞裂解液中的泛素化修饰组转化成甘氨酸-甘氨酸二肽修饰的蛋白质组,再结合LC-MS对多泛素链中不同分支点的泛素进行定量,进而映射出蛋白上连接的多泛素链结构的全貌。然而,由于Lbpro*识别泛素的特异性和活性不高,还未被大规模的应用在泛素化修饰的研究当中。本文利用理性设计和定向进化等方法对Lbpro*进行了分子改造。首先,搭建了一个基于荧光共振能量转移技术的高通量检测系统。分析Lbpro和泛素相互作用的界面,并选择L143、L178进行了饱和突变建库,利用建立的高通量检测体系进行了一轮筛选。随后,通过Rosetta计算,对Lbpro进行定点突变,验证了106、131位点对于活性提高的作用。最后,通过嵌合苯丙氨酸翻译系统在L102位点引入了7种色氨酸类似物,对102位点的作用机制进行了探究。