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猪丹毒是由猪丹毒丝菌(E.rhusiopathiae)引起的一种急性、热性人畜共患传染病,属于我国农业农村部公布的二类动物疫病,主要侵害猪发生败血症、心内膜炎和多发性关节炎。自2010年以来,我国许多省份均出现了猪丹毒的暴发流行,造成了严重的经济损失。疫苗免疫接种和抗生素治疗是目前防治猪丹毒的有效手段。β-内酰胺类(β-lactams)抗生素是防治猪丹毒的常用药物,其中青霉素(Penicillin,PG)一直都是首选和最有效的。然而,由于兽医临床上长期不合理的使用抗生素,导致细菌耐药性不断产生且日趋严重。本实验室通过对安徽、江苏、山东、河北、广西等五省部分地区的猪细菌病流行病学调查,发现并获得一株对PG产生抗性的E.rhusiopathiae。基于了解E.rhusiopathiae出现耐受PG的原因,本研究运用转录组学与蛋白质组学进行了初步探索,旨在为进一步开展E.rhusiopathiae耐药机制的研究奠定基础。本研究以E.rhusiopathiae PG耐药株(代号AEr51)、E.rhusiopathiae标准株ATCC19414(代号AEr S)和E.rhusiopathiae PG敏感株(代号AEr31)为受试菌株进行以下试验:(1)采用纸片琼脂扩散法(K-B法)检测三株受试菌株对26种β-lactams抗生素的感受性,确定有无多重耐药(MDR);采用微量稀释法测定三株受试菌株对PG、阿莫西林(AMX)和氨苄西林(AMP)的最小抑菌浓度(MIC)。(2)利用转录组学测序(RNA-seq)技术筛选三株受试菌株的耐药相关差异表达基因,结合生物信息学分析比较基因表达的变化。同时采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)验证和确定RNA-seq结果的可靠性。(3)采用串联质谱标签法(TMT)定量蛋白质组学技术筛选三株受试菌株的耐药相关差异表达蛋白,结合生物信息学分析比较蛋白表达的变化。随机筛选部分差异表达蛋白进行平行反应监视(PRM)靶向验证TMT分析结果的准确性。结果显示:(1)AEr51对青霉素耐受,对阿莫西林、氨苄西林、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢拉定、头孢曲松、头孢呋辛、头孢噻肟均敏感,AEr S和AEr31对全部β-lactams抗生素均敏感。AEr51、AEr S和AEr31对林可胺类、四环素类抗生素敏感,对个别如庆大霉素、链霉素、替米考星出现耐药现象。三株受试菌株对26种抗生素均无MDR。AEr51对PG的MIC为32μg/m L,达高度耐药(MIC≥16-20μg/m L),对AMX和AMP的MIC分别为4μg/m L和2μg/m L,为中度敏感(MICs,0.1-25μg/m L);AEr S和AEr31对PG、AMX和AMP均高度敏感(MICs≤0.025-0.78μg/m L)。(2)以|log2(Fold Change)|>1且qvalue<0.005为条件筛选差异表达基因,AEr51/AEr S比较组中共筛到668个差异基因,其中上调434个,下调234个;AEr51/AEr31比较组中共筛到403个差异基因,其中上调275个,下调128个。生物信息学分析差异表达基因主要富集于代谢途径、ABC转运系统、双组分信号传导系统、β-内酰胺抗性等通路。q RT-PCR检测随机筛选的7个耐药相关差异表达基因结果与RNA-seq的基本一致。(3)以1.2倍为变化阈值(Fold change≥1.2或≤0.83),P≤0.05为标准筛选差异表达蛋白,AEr51/AEr S比较组中共筛到167个差异蛋白,其中上调86个,下调81个;AEr51/AEr31比较组中共筛到159个差异蛋白,其中上调80个,下调79个。生物学信息分析差异表达蛋白显著富集于微生物、氨基酸、碳、硫、嘧啶代谢等相关的代谢通路。PRM靶向验证随机选取的7个耐药相关差异表达蛋白结果与TMT的趋势一致。结果表明:本研究通过纸片琼脂扩散法(抑菌圈直径测定)和微量稀释法(MIC测定),确证受试菌株AEr51和AEr31分别为对PG耐受和敏感的E.rhusiopathiae。RNA-seq共筛选出21个耐药相关差异表达基因,涉及外排泵、趋化性、双组分系统等。TMT定量蛋白质组学共筛选出18个耐药相关差异表达蛋白,主要包括ABC转运蛋白和PBP蛋白。