论文部分内容阅读
目的: 检测肾癌组织和肾癌细胞株中lncRNA HOTAIR的表达量以及HOTAIR调控对在肾癌细胞株生物学功能的影响,阐明HOTAIR在肾细胞癌进展中所起到的作用;通过基因共表达分析验证HOTAIR与alpha-2,8-sialyltransferase4(ST8SIA4)基因的表达谱关系,并探讨HOTAIR/miR-124/ST8SIA4轴在肾癌进展中的潜在影响。 方法: (1)利用qPCR技术测定肾细胞癌组织、对应癌旁组织、肾癌细胞株(786-O和ACHN)及正常人肾上皮细胞HEK-293中HOTAIR的表达量;分析HOTAIR与临床病理因素之间的关系;应用荧光原位杂交技术对肾癌组织和细胞株中HOTAIR进行定位。 (2)采用siRNA技术干扰HOTAIR(siHOTAIR)表达和对照siSCR,构建过表达HOTAIR的细胞株和对照细胞株。采用平板单克隆、免疫荧光实验(EdU实验和Ki67实验)等检测细胞增殖能力并通过FACS系统检测细胞凋亡率;通过划痕及transwell实验检测肾癌细胞株迁移及侵袭水平;利用裸鼠皮下成瘤实验检测肾癌细胞在裸鼠体内的成瘤情况。 (3)为了进一步探究HOTAIR在肾癌中发挥作用的机制,我们考虑从ceRNA的角度进行分析和研究,应用生物信息学软件、starbase v2.0和targetscan等预测网站,对HOTAIR进行分析,找出合适的miRNA:microRNA-124(miR-124),并利用双荧光素酶报告基因检测试验、qPCR、Western blot等分子生物技术对miRNA和HOTAIR及miRNA和ST8SIA4的关系进行评估。 (4)利用免疫组织化学实验(IHC)对肾癌及癌旁组织中ST8SIA4的表达进行检测;并利用IPP6.0软件对免疫组化染色结果进行分析;通过细胞生物学实验检测ST8SIA4表达对肾癌细胞株增殖和侵袭能力的影响。 (5)利用qPCR、Western blot方法检测HOTAIR和miR-124对ST8SIA4mRNA和蛋白质表达水平的影响。 结果: (1)通过qPCR检测表明,在肾癌组织中lncRNA HOTAIR表达水平较癌旁组织明显升高,且具有统计学意义,同时HOTAIR的表达量与肾癌的远处转移具有明显相关性;通过分析荧光原位杂交结果,HOTAIR在肾癌组织中高表达,且定位于细胞质和细胞核中。 (2)平板克隆形成、免疫荧光试验结果表明,HOTAIR过表达后,肾癌细胞体外增殖能力明显增强、细胞凋亡率降低,同时相关凋亡蛋白表达量降低;划痕及transwell实验提示,特异性上调HOTAIR能促进肾癌细胞的迁移及侵袭能力;裸鼠皮下成瘤实验表明,过表达HOTAIR的肾细胞在裸鼠体内成瘤能力增加。 (3)利用Starbase v2.0等预测软件分析HOTAIR与miRNA的靶向关系,通过荧光素酶报告基因试验、RNA免疫共沉淀实验及Western blot实验验证了miRNA和HOTAIR具有靶向关系。生物信息学软件分析ST8SIA4与miR-124存在结合位点;Western blot实验、qPCR实验等结果显示,相比于正常的肾脏组织和上皮细胞,miR-124在肾癌组织及细胞株中的表达量降低;而ST8SIA4与miR-124表达量在肾癌组织中呈负相关,ST8ISA4mRNA和蛋白量受miR-124调控。 (4)qPCR及免疫组化实验结果显示,在肾癌组织和肾癌细胞中ST8SIA4的表达量明显高于癌旁组织和正常肾上皮细胞;克隆形成实验、EdU染色实验结果显示,过表达ST8SIA4促进肾癌细胞增殖;划痕及transwell实验结果显示,ST8SIA4过表达促进肾癌细胞的迁移和侵袭;裸鼠皮下成瘤实验表明,上调ST8SIA4,肾癌细胞的体内成瘤能力增强。 (5)根据竞争性内源RNA(ceRNA)假说的基础理论,我们认为HOTAIR可能通过竞争性结合miR-124调控促进原癌基因ST8SIA4表达并参与肾癌的发生发展。克隆形成、EdU、transwell实验证明HOTAIR及miR-124调节ST8SAI4表达进而影响肾癌细胞的发展进程。 结论: (1)HOTAIR在肾癌组织及细胞株中呈高表达,且与肿瘤远处转移呈正有关。 (2)过表达HOTAIR可增强肾癌细胞株的增殖和转移能力。 (3)HOTAIR竞争性结合miR-124对ST8SIA4发挥调节作用,进而影响肾癌肿瘤发展进程。