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目的:通过分析第7次霍乱弧菌大流行期间,O1群El Tor型霍乱弧菌产毒株的hlyA基因和溶血表型之间的关系,揭示在第七次霍乱大流行期间导致O1群El Tor型霍乱弧菌产毒株溶血表型差异的原因。方法:对1961~2011年分离的294株O1群El Tor型霍乱弧菌产毒株进行溶血表型验证,并从已有的全基因组草图中提取或扩增菌株hlyA基因,得到hlyA序列后进行进一步的序列分析。比较菌株溶血素基因hlyA的序列变异及不同序列型的分布,构建这些菌株的核心基因组进化树,分析非溶血株在进化分支中的分布及克隆化特征。并挑选85株实验菌株进行进一步的实验分析。对部分菌株通过hlyA基因敲除、回补或高表达等方法研究hlyA基因对溶血表型的影响。并通过逆转录cDNA后进行qRT-PCR从而检测hlyA相对转录水平。借助超声破碎方法,检验实验菌株分泌溶血素是否受阻。最后综合分析讨论hlyA基因突变与O1群E1 Tor型霍乱弧菌产毒株溶血表型的关系,并初步解释了部分菌株溶血表型为阴性的产生原因。结果:1.294株O1群El Tor型霍乱弧菌产毒株实验菌株中,hlyA基因携带率为100%。在第七次霍乱世界大流行背景下,我国第一个霍乱流行高峰期分离的60株菌株中,溶血表型均为阳性。第二个霍乱流行高峰期分离的75株菌种,45株为溶血阳性,30株为溶血阴性。第三个霍乱流行高峰期中分离的114株菌种共有64株为溶血阳性,50株溶血阴性。在随后的散发期,共收集到45株O1群El Tor型霍乱弧菌,其中26株为溶血阳性,19株为溶血阴性。2.通过与O1群El Tor型霍乱弧菌产毒株标准株C6706的hlyA基因比对,将挑选的用于进一步功能研究的85株实验菌株分为ST.1-5共5种序列型别。hlyA基因为ST.1型菌株共37株。ST.2型hlyA基因与ST.1型序列相比、在1358位存在一点突变(胸腺嘧啶突变为胞嘧啶)。第七次大流行初期的菌株几乎全为ST.2型。ST.3型除在1979位存在一同义突变外,ST.2型相同。ST.4、ST.5型hlyA基因在1088-1091缺失了共四位碱基。另外ST.5型还具有ST.2型的点突变位点。3.ST.2型菌株分离时间为第七次大流行初期,且溶血表型全部为阳性。ST.1、ST.3、ST.4、ST.5型菌株分离时间较晚,且存在溶血阴性表型菌株。4.在中国第七次霍乱流行中,溶血素基因hlyA在第一次流行高峰期后,出现了明显的序列型转换。非溶血株主要出现在始于七十年代的第二次流行中,并成为多见的变异型。非溶血菌株分布在不同流行期和流行克隆中,没有形成单一的克隆化。但部分非溶血菌株克隆引起数年的流行扩散。5.O1群El Tor型霍乱弧菌产毒株参照菌株C6706为溶血阳性菌株。敲除掉hlyA基因后失去溶血活性,将携带有hlyA基因的pBAD33表达质粒回补至缺失株后恢复溶血活性。6.克隆ST.2-ST.5型hlyA基因并回补至C6706缺失株中,CΔhlyA-C-ST.2、CΔhlyA-C-ST.3 溶血阳性,CΔhlyA-C-ST.4、CΔhlyA-C-ST.5 溶血阴性。7.12株ST.1型溶血阴性菌株(ST.1H-)中,7株细胞胞浆溶液溶血阳性、5株细胞胞浆溶液溶血阴性。将pBAD33-hlyA转至这12株ST.1H-菌株中,使hlyA在菌株内高表达。八株高表达后的ST.1H-菌株获得了溶血活性,还有4株仍为溶血阴性。超声破碎四株高表达hlyA的菌株后仍为溶血阴性的菌株,其细胞内容物溶液为溶血阳性。结论:在第七次全球霍乱大流行中,我国1961年开始发生霍乱流行后不久,就出现了非溶血表型的El Tor型霍乱弧菌流行菌株,并在此后的流行过程中溶血阴性菌株的分离比例逐渐上升。这一结果与之前报道的亚洲和美洲等地区的霍乱弧菌溶血表型变化相似,说明我国作为亚洲霍乱传播的一部分,也参与了大洲间、国家间的菌株传播。对O1群El Tor型霍乱弧菌产毒株的hlyA基因测序和溶血活性分析、确定ST.2型hlyA基因是O1群El Tor型流行菌株中最常见的野生型hlyA基因,其他四种hlyA序列型是流行过程中基因突变形成。O1群El Tor型菌株的非溶血变异独立于基因组逐年累积的克隆进化,很可能是一种随机性较强的变异。多种因素影响霍乱弧菌流行菌株的溶血表型,其中hlyA基因内4个碱基的缺失突变导致了部分菌株呈现溶血阴性,另外,hlyA转录水平降低以及溶血素HlyA分泌受阻,也是造成菌株溶血阴性表型的原因,其中在非溶血菌株中hlyA转录水平降低相对更多见。本课题也为进一步深入研究这些菌株的非溶血突变提示了方向,hlyA基因转录调节以及在溶血素分泌缺陷应是今后研究的重点。