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泽泻汤始载于东汉张仲景的《金匮要略》,由泽泻、白术两味药5:2配伍而成。其君药泽泻为泽泻科植物东方泽泻Alisma orientate（Sam.）Juzep.或泽泻Alisma plantago-aquatica Linn.的干燥块茎,臣药白术为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎。泽泻汤具有治水饮、祛痰湿的功效,自古沿用十分广泛。近年的基础及临床研究证明,泽泻汤具有较强的降脂及抗炎活性;课题组前期研究结果表明,泽泻汤95%乙醇提取物在体外具有抗非酒精性脂肪肝（NAFLD）作用。为进一步深入研究泽泻汤抗NAFLD的有效成分及其分子机制,本论文在前期研究的基础上,对泽泻汤95%乙醇提取物抗高脂饮食诱导的SD大鼠非酒精性脂肪肝药效作用进行了验证;对泽泻汤95%乙醇提取物主要化学成分进行了定量分析;对泽泻汤95%乙醇提取物入血和达靶成分进行了鉴定,并对其部分成分开展了药代动力学研究;对潜在有效成分进行了药效学验证,明确了泽泻汤抗NAFLD的主要有效成分。此外,通过网络药理学、临床数据挖掘和真核有参转录组学等研究手段,对泽泻汤95%乙醇提取物抗NAFLD分子机制进行了预测,并利用qRT-PCR技术进行验证;通过高分辨广谱脂质组绝对定量联合16S rDNA扩增子测序技术,从差异脂代谢物和差异菌群的角度对泽泻汤95%乙醇提取物抗NAFLD进行了深入的分子机制探讨。具体研究内容如下:1.泽泻汤95%乙醇提取物抗高脂饮食诱导的SD大鼠非酒精性脂肪肝药效学研究实验选取SD大鼠为研究对象,利用高脂饮食诱导NAFLD疾病模型,以400、200、100 mg/kg/d的给药剂量评价泽泻汤95%乙醇提取物抗NAFLD的体内药效。TC、TG、AST、ALT血清生化检测和HE、ORO组织病理学检查结果显示泽泻汤95%乙醇提取物具有显著的抗NAFLD作用,能够降低受试动物的摄食量,且具有剂量依赖性。因此泽泻汤95%乙醇提取物具备进一步挖掘其潜在有效成分的价值。2.基于UHPLC-Q-TRAP-MS/MS的泽泻汤化学成分定量分析基于课题组前期泽泻汤UHPLC-Q-TOF-MS定性和半定量分析结果,通过查阅文献,选取了其中8种主要的化学成分,即alisolA,alisolA24-acetate,alisolB,alisol B 23-acetate,alisol C 23-acetate,atractylenolide Ⅰ,atractylenolide Ⅱ 和 atractylenolide Ⅲ。采用UHPLC-Q-TRAP-MS/MS技术,对泽泻汤水提物和95%乙醇提取物中上述8种成分进行了定量分析。实验结果显示,泽泻汤95%乙醇提取物中8种成分的含量分别为 1.5506 mg/g、0.42756 mg/g、1.75713 mg/g、2.24006 mg/g、0.12238 mg/g、0.02198 mg/g、0.03413 mg/g、0.01416 mg/g。泽泻汤水提物分别为 0.55244 mg/g、0.04276 mg/g、0.42606 mg/g、0.48727 mg/g、0.03293 mg/g、0.00602 mg/g、0.01960 mg/g、0.01461 mg/g（均为生药量）。课题组前期研究结果显示泽泻汤95%乙醇提取物的体外抗NAFLD活性比水提物更强,可能与这些成分密切相关。3.基于 UHPLC-QE-Orbitrap-MS 和 UHPLC-Q-TRAP-MS/MS 的泽泻汤 95%乙醇提取物入血成分、达靶成分定性分析和药代动力学研究选取Sprague Dawley（SD）品系大鼠,将泽泻汤95%乙醇提取物以750 mg/kg的给药剂量单次灌胃给药,并于给药后20 min,40 min,1.5 h,2 h,3 h,4.5 h,6 h,8 h,10h,12 h,24 h通过眼眶静脉丛采血收集血样并制备含药血浆;取NAFLD模型动物给药后20 min,40 min,1.5 h,4.5 h的肝组织样品并制备含药组织提取液。分别将以上生物样品通过优化的UHPLC-QE-Orbitrap-MS和UHPLC-Q-TRAP-MS/MS方法进行泽泻汤95%乙醇提取物入血成分、达靶成分的定性分析和药代动力学研究。本实验开发了快速、准确、灵敏的定性定量分析方法,共鉴定出包括alisol A,alisol B,alisol B 23-acetate,alisol C,16-oxo-alisol A,atractylenolide Ⅰ,atractylenolide Ⅱ和 atractylenolide Ⅲ 等在内的 25 种入血成分,包括 16-oxo-alisol A,alisol C,alisol F,11-deoxy-alisol C,alisol K/J,atractylenolide Ⅰ,atractylenolide Ⅱ 和 atractylenolide Ⅲ 等在内的18种达靶成分,主要化合物类型为三萜类和内酯类,即泽泻醇和白术内酯;通过药代动力学研究得到了 3种三萜类化合物的药时曲线图,并发现这3种成分具有较好的生物利用度,为潜在有效成分。上述实验结果为进一步的药效物质基础研究和质量控制提供了依据。4.基于HepG2脂肪累积模型的单体成分药效学验证采用油酸诱导的HepG2脂肪累积模型,针对上述实验中发现的3种潜在有效成分的体外抗NAFLD药理活性进行初步的药效学验证。实验结果显示alisol A,alisol B和alisol A 24-acetate在浓度为50.0,25.0,12.5 μM的浓度下表现出显著的抑制脂肪累积的作用,并且具有剂量依赖性。此外,3种单体化合物在50μM的浓度下对HepG2细胞的细胞毒性均小于10%,因此初步证实了泽泻汤中的上述3种单体成分可能通过抑制脂肪累积发挥体外抗NAFLD作用。5.基于网络药理学和临床数据挖掘的泽泻汤95%乙醇提取物分子机制预测基于上述3种有效成分的结构,并结合文献调研,采用TCMSP数据库、PubChem数据库、SwissTargetPrediction平台、OMIM数据库、GeneCards 数据库、Metascape分析平台、String分析平台、PDB数据库、Uniprot数据库、Cytoscape 3.7.2等网络药理学的研究平台、数据库和分析软件,对泽泻汤95%乙醇提取物抗NAFLD的分子机制进行预测。基于文献和数据库结果筛选出泽泻汤中的潜在活性成分共19个,其中归属于泽泻、白术的成分分别匹配出325、327个靶点。根据疾病数据库,共找到1575个与NAFLD相关的靶点,与泽泻、白术相匹配的交集靶点共186个。蛋白互作分析和多项生物富集富集分析显示,泽泻汤可能通过胰岛素抵抗相关通路、PI3K/AKT通路以及脂代谢相关通路等发挥抗NAFLD作用,其中涉及到可能的关键靶点为 HMGCR,AKTs,PPARs,MAPKs,LXRs,CYP450s,FABPs以及MMPs等等,这些通路和靶点可以为后续的药理学验证提供参考。此外,对GEO数据库中10批NAFLD、NASH、胰岛素抵抗或严重肝脏脂肪变性患者的组织样本微阵列基因表达谱数据进行了临床数据挖掘,初步确定了对4种靶蛋白CYP7B1、STAT3、PPARD、INSIG2进行机制研究的可行性。6.泽泻汤95%乙醇提取物抗高脂饮食诱导的SD大鼠非酒精性脂肪肝分子机制初步探讨在药效学研究的基础上,基于多组学联合应用的研究方法,探究泽泻汤95%乙醇提取物抗NAFLD的分子机制。一方面,基于真核有参转录组测序将肝组织的差异表达基因所对应的蛋白与网络药理学预测的靶点互相补充。结果与阴性对照组相比,空白组共发现具有显著差异表达水平的基因218个,给药组共发现71个,并以qRT-PCR技术分析部分基因的表达水平以进行分子机制初步验证。另一方面,通过高分辨广谱脂质组绝对定量联合16S rDNA扩增子测序技术从差异代谢物和差异菌群的角度进行分子机制研究。研究发现在脂质亚类和OTUs的水平上,不同组别的受试动物均存在较大差异。在高分辨广谱脂质组绝对定量研究中,我们发现PC、PE、PI、PS、SM、LPE等亚类下的脂质分子如PE（16:0/18:1）、PI（18:2/20:4）、DG（18:0/18:1）可能是潜在的生物标志物。在16S rDNA扩增子测序研究中,我们发现泽泻汤95%乙醇提取物可能通过调节gBlautia、gRomboutsia、gLactobacillu等菌属的相对丰度而发挥抗NAFLD作用。综上所述,本论文在课题组前期研究的基础上,从泽泻汤95%乙醇提取物有效成分和分子机制两个角度出发,针对其抗NAFLD作用进行了全面、深入的研究,初步地解决了当前泽泻汤抗NAFLD有效成分及分子机制尚不明确的问题,为其更为广泛的临床应用及非酒精性脂肪肝的预防和治疗提供重要参考。