卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤,临床上,肿瘤细胞减灭术和铂类为主的药物化疗是治疗卵巢癌的主要手段。但美国的一项研究表明,即使术后长期化疗,其5年生存率仍一直徘徊在30%,究其原因,是因为卵巢癌细胞在化疗的过程中产生耐药性,影响了化疗的疗效。故卵巢癌耐药的发生及逆转机制己成为当前极其紧迫而重要的研究课题,其中铂类耐药的相关研究则成为卵巢癌化疗耐药研究的重中之重。普遍认为信号转导机制在铂类耐药中作用显著,铂类引起的DNA损伤可以通过激活多种信号转导途径进而激活细胞凋亡信号,当信号转导途径被异常激活或抑制时,细胞会表现出对铂类药物的抵抗、凋亡抑制。顺铂作为金属铂类化合物,其主要毒性机制是引起DNA链间交联,破坏DNA结构,进而抑制DNA复制和转录。Westfall等[23]报道,顺铂在多种肿瘤细胞中激活PI3K/Akt信号通路,并与这些细胞对药物的抵抗有关。顺铂可以激活Akt,使Akt下游蛋白磷酸化, PI3K抑制剂可以阻断这些现象,提高细胞对顺铂的敏感性。本实验首先应用免疫组化方法检测卵巢癌组织中磷酸化Akt和P-gp表达,并进行相关性分析,结合临床资料得出结论:p-AKT和P-gp共阳性表达与上皮性卵巢癌组织化疗耐药关系密切,p-AKT过表达对P-gp阳性表达可能具有促进作用。为了进一步探讨其中的机制,本实验以体外建立的铂类耐药细胞株和其亲代细胞株为研究对象,首先对其耐药指数进行了检测和鉴定,接着采用免疫细胞化学技术对耐药细胞株和亲代细胞株中的Akt分型进行检测,应用western blot对耐药细胞株和亲代细胞株中的磷酸化Akt进行检测,为下一步的Akt特异性抑制剂逆转卵巢癌耐药研究打下了基础。本实验首次选用AKT活性抑制剂API-2在体外研究中逆转卵巢癌顺铂耐药,结果显示,API-2确实可以达到抑制Akt活性的目的,与对照组SKOV-3/DDP和SKOV-3细胞相比,API-2预处理细胞组半数抑制浓度IC50值明显降低,AnnexinⅤ/PI染色法的流式细胞仪结果与AnnexinⅤ/PI染色共聚焦显微镜下看到的结果基本吻合,API-2预处理细胞组的凋亡率更高,卵巢癌顺铂耐药性在体外得到改善。YB-1是DNA/RNA结合的核与质的穿梭运动蛋白,它对许多DNA和RNA依赖事件的调节效应是由它在细胞内的定位决定的。YB-1在细胞核与细胞质内的分布是由位于YB-1 C-末端区域的核靶向和细胞质内保留的信号决定的。然而,作为一个核与质的穿梭运动蛋白,明白哪一个信号分子参与YB-1的核转位是非常重要的。最近的研究发现Akt作为一个上游酶,磷酸化人类的YB-1在其冷休克结构域的serine 102位点[26, 27],这在癌细胞YB-1核转位是必需的。Akt活化调节YB-1核转位,影响耐药基因和其他与卵巢癌恶性特征相关基因的表达;在异种移植动物模型,Akt抑制剂的加入导致YB-1核阳性的卵巢癌细胞减少[11]。因此,Akt途径可能是干扰YB-1核转位的新靶标,这在卵巢癌治疗策略进一步发展上具有重要的意义。YB-1蛋白能直接参与MDR1基因活性的调节,同时,YB-1蛋白也和肿瘤细胞内由多药耐药基因(Multidrug Resistance Gene 1,MDR1)编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein)的过表达有关,而P-糖蛋白在肿瘤细胞中的高表达是引起多药耐药的主要原因。临床实验中发现:在乳腺癌、前列腺癌的发生中,YB-1蛋白被上调之后促进了P-糖蛋白的活性及P-糖蛋白的上调[28, 29, 30]。由此说明,YB-1蛋白间接的使肿瘤细胞产生了耐药性。此外,YB-1能直接结合在经顺铂作用的DNA和修复蛋白上,像细胞核增殖抗原(PCNA),这些功能可能对药物抗性的获得也有帮助[31]。因此,PI3K/AKT细胞信号通路是否通过YB-1核转位来调控卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP中P-糖蛋白的表达是本研究的主要内容,目前关于这一推断方面的研究还未见报道。