【摘 要】
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目的和意义:纳米药物载体在应用过程中最终都要进入血液,补体系统是纳米颗粒接触的重要防线,并将始终参与免疫应答的每一步,且由于血液中存在多种免疫细胞,纳米颗粒很可能通过影响补体系统而导致一系列的免疫学应答,这也提示研究纳米颗粒-补体-免疫细胞相互关系的必要性。目前,纳米颗粒通过激活补体介导的免疫学效应等科学问题仍然不清楚。本课题通过对常用的三种无机纳米药物载体进行毒理学的筛选,选择羟基磷灰石纳米颗粒
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（81271700）；
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目的和意义:纳米药物载体在应用过程中最终都要进入血液,补体系统是纳米颗粒接触的重要防线,并将始终参与免疫应答的每一步,且由于血液中存在多种免疫细胞,纳米颗粒很可能通过影响补体系统而导致一系列的免疫学应答,这也提示研究纳米颗粒-补体-免疫细胞相互关系的必要性。目前,纳米颗粒通过激活补体介导的免疫学效应等科学问题仍然不清楚。本课题通过对常用的三种无机纳米药物载体进行毒理学的筛选,选择羟基磷灰石纳米颗粒（HAP-NPs）和二氧化硅纳米颗粒（SiO2-NPs）为研究对象,在探讨颗粒对补体激活效应及调控机制的基础上,试图揭示HAP-NPs和SiO2-NPs活化的补体对免疫细胞的损伤作用,并结合单核细胞对“纳米颗粒-蛋白质环”的识别机制,阐明纳米颗粒-补体-免疫细胞三者间的关系,为规避纳米药物载体的应用风险提供科学依据。材料和方法:（1）通过细胞增殖和氧化应激等试验,筛选三种纳米颗粒（HAP-NPs、SiO2-NPs和Fe3O4-NPs）的毒性作用,并深入开展HAP-NPs和SiO2-NPs的系统生物安全性评价。（2）利用LC-MS技术对HAP-NPs和SiO2-NPs吸附的补体进行定性、定量及生物信息学分析。（3）通过iC3b/Sc5b-9/C3a/C4a/C5a表达变化,分析HAP-NPs和SiO2-NPs对补体的激活效应;利用EDTA/EGTA/anti-C1q/anti-CFB建立两种纳米颗粒激活补体的抑制模型,通过iC3b的变化分析颗粒引起补体激活的途径,并探讨可溶性蛋白和膜蛋白在补体激活中的调控作用。（4）将HAP-NPs和SiO2-NPs激活的补体片段分别诱导单核细胞（THP-1）和内皮细胞（HUVECs）,通过分析细胞因子、粘附分子、花生四烯酸产物表达的变化,以及氧化应激反应,揭示两种纳米颗粒通过补体激活引起的免疫学效应。（5）建立纳米颗粒-补体-THP-1共孵育体系,利用流式技术分析THP-1膜表面TLR4/CR1/CR3的变化,揭示单核细胞识别HAP-NPs和SiO2-NPs的机制。结果:（1）与Fe3O4-NPs相比,HAP-NPs和SiO2-NPs对细胞增殖有明显的不良影响;而连续体内注射7d/14d后,这两种纳米颗粒分别引起肺和肝脏组织的损害,以及血红蛋白、平均红细胞体积、红细胞压积等指标明显降低。（2）HAP-NPs和SiO2-NPs吸附了21个补体相关蛋白,属于细胞组分（Cellular Component）。HAP-NPs对SP和CD59有明显吸附,而SiO2-NPs对C1q家族及CFD和CFB有选择性吸附。（3）HAP-NPs能引起iC3b、C3a、C4a、C5a和Sc5b-9明显升高;SiO2-NPs可导致iC3b的产生,但对C3a、C4a、C5a和Sc5b-9有明显吸附。同时,EDTA/EGTA能够同时抑制HAP-NPs介导的补体激活,且在反应中C4bp、CFI、SP表达明显增加。仅EDTA能抑制SiO2-NPs介导的补体激活,在反应中CFH、CFP表达明显增加。（4）HAP-NPs和SiO2-NPs激活的补体片段均能够明显引起THP-1细胞ROS、TNF-a、LTB以及Histamine表达增加,并导致NF-κB激活。HAP-NPs激活的补体片段仅能引起HUVECs粘附分子E-selectin明显升高,而SiO2-NPs则引起ICAM-1和VCAM-1表达增加。（5）吸附补体蛋白的HAP-NPs仅诱导CR3的表达,而吸附补体蛋白的SiO2-NPs可同时引起TLR4/CR1/CR3上调。结论:（1）HAP-NPs和SiO2-NPs比Fe3O4-NPs具有更明显的细胞毒性,且随着体内接触时间的增加,这两种纳米颗粒可引起血液成分及病理组织学的改变。（2）随着纳米颗粒-蛋白质环的形成,HAP-NPs和SiO2-NPs对不同激活途径的补体蛋白有选择性的吸附。（3）HAP-NPs吸附C1q并释放C1r/C1s,导致了经典途径的补体激活;SiO2-NPs明显吸附C1r/C1s、CFD和CFB,导致替代途径的补体激活。（4）HAP-NPs和SiO2-NPs通过激活补体对THP-1和HUVECs有损伤作用,包括利用NF-κB通路致单核细胞的氧化应激损伤,诱导白细胞聚集粘附、细胞因子表达导致炎症反应,以及增加血管通透性造成内皮细胞的损伤等。（5）HAP-NPs-蛋白环仅通过iC3b/CR3的模型被单核细胞识别;而SiO2-NPs-蛋白环则可能通过TLR4、CR1或CR3被识别。由此提示,在药物载体的应用过程中,可通过表面改性等方法来规避颗粒被免疫细胞清除的可能。
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