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B7-1（又称CD80）是主要表达于抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)表面的重要共刺激分子。B7-1与相应的受体CD28结合，介导的共刺激信号，是T、B细胞活化、增殖、分化进而发挥免疫效应所必需的。缺乏该信号，T细胞将进入无反应状态（Anergy）或免疫耐受（Tolerance），甚至程序性死亡（Apoptosis）。 自身免疫性疾病（autoimmune disease，AID）是自身反应性T、B淋巴细胞过度活化，导致大量自身抗体生成，进而累及多系统、多器官的一类严重疾病。系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是其典型代表。B7/CD28信号通路的过度活化与自身免疫性疾病的发生密切相关，已有文献报道B7-1和B7-2单克隆抗体可有效减少SLE模型小鼠免疫细胞的活化，自身抗体的生成，逆转SLE的肾脏病理损伤。 嵌合抗体（chimeric antibody）是由鼠源性抗体的可变区基因与人源性抗体的恒定区基因拼接而成的嵌合基因，插入载体后转染至中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)表达的抗体分子。因其减少了鼠源成分，从而降低了人抗鼠抗体反应(human anti-murine-antibody response，HAMA)的发生，成为了新的研究热点。 本课题在建立和人红斑狼疮类似的慢性移植物抗宿主病（cGVHD）小鼠狼疮样肾炎模型并对其进行生物学鉴定的基础上，运用自行研制的B7-1人-鼠嵌合抗体对该疾病模型进行干预。通过免疫学、血清学及肾脏组织形态学等指标动态评价嵌合抗体对疾病模型的免疫干预效应，同时为该类疾病寻找新的高效、特异、低毒的免疫干预手段。 一、B7-1人-鼠嵌合抗体的制备及鉴定 目的：制备B7-1人-鼠嵌合抗体并对其生物学特性进行鉴定。 方法：采用细胞大规模培养法制备嵌合抗体；Protein G免疫亲和层析法分离纯化抗体；流式细胞术分析嵌合抗体对人及小鼠细胞膜型B7-1分子抗原表位的识别。 结果：经Protein G亲和层析柱分离纯化，细胞培养上清中嵌合抗体蛋白的得率约为25mg/L；B7-1嵌合抗体与L929-B7-1、Daudi以及小鼠脾脏细胞的阳性结合率分别为94.2％、93.8%及65.4%。 结论：本研究所用B7-1人-鼠嵌合抗体既能识别人的B7-1分子抗原表位又能识别鼠的B7-1分子抗原表位。 二、慢性移植物抗宿主病小鼠狼疮样肾炎模型的建立及生物学鉴定 目的：构建cGVHD小鼠狼疮样肾炎模型，并通过免疫学、血清学和组织形态学对其进行生物学鉴定。 方法：将30只6~8周龄雌性( C57BL/6×BALB/ c)BCF1小鼠随机分为2组，模型组于0、3、7和11d经眼眶静脉注射亲代BALB/c小鼠脾脏淋巴细胞107/100μL/只。对照组给予等体积生理盐水。末次注射后第7天，双色免疫荧光及流式细胞术分析小鼠脾脏淋巴细胞活化情况；每2周定期检测小鼠血清中抗dsDNA抗体及ANA含量；每4周试纸法定期检测尿蛋白含量。实验的第12周处死所有小鼠，取肾脏HE染色观察肾脏组织病理改变，直接免疫荧光法检测免疫复合物（IC）的沉积情况及透射电镜法观察肾小球超微结构的改变。 结果：模型组小鼠脾脏细胞抗原递呈细胞（MHCⅡ+细胞）膜型CD11b+，CD11c+和Gr1+的比例较对照组明显上升（P<0.05），抗体形成细胞（B220+）上B细胞表面活化标志CD21和CD23及共刺激分子CD80和CD86的表达明显上升（P<0.05），同时T细胞表面活化标志CD4、CD8a、CD25、CD28和CD152表达也明显上升（P<0.05）；12周时，100%的模型组小鼠出现蛋白尿；4周时，血清中抗dsDNA抗体和ANA阳性率分别为50%和90%；HE染色镜下观察,模型组肾小球肿胀，有淋巴细胞浸润及新月体生成；直接免疫荧光法可见肾小球血管襻有大量IC沉积；透射电镜下可见模型组小鼠肾基底膜节段性增厚，大量电子致密物沉积。 结论：本研究成功建立可靠的cGVHD小鼠狼疮样肾炎模型。 三、B7-1人-鼠嵌合抗体对小鼠狼疮样肾炎的免疫干预效应及分子机制的研究 目的：运用B7-1人-鼠嵌合抗体对狼疮样肾炎模型小鼠的进行免疫干预效应并探讨其分子机制。 方法：按第二部分建模方法建模，取BCF1代小鼠随机分为抗体干预组、CTX干预组和模型组。抗体干预组在末次注射淋巴细胞后第1、3、5、8、15、30及60d分别经眼眶静脉注射B7-1嵌合抗体(克隆号2B11)200μg/100μL/只，CTX干预组在末次注射淋巴细胞后第1、3、5、8、15天分别腹腔注射CTX2.5mg/100μL/只。按照上述时间点取材分析小鼠脾脏淋巴细胞活化情况，抗dsDNA抗体、ANA及尿蛋白含量，观察肾脏组织HE染色，免疫复合物（IC）沉积，肾小球超微结构改变等情况。 结果：流式细胞术结果显示，抗体干预组小鼠脾脏抗原递呈细胞（MHCⅡ+细胞）膜型CD11b+，CD11c+和Gr1+的比例较模型组明显降低（P<0.05），抗体形成细胞（B220+）上B细胞表面活化标志CD21和CD23以及共刺激分子CD80和CD86的表达明显降低（P<0.05），同时T细胞表面活化标志CD25、CD28和CD152表达也明显降低（P<0.05）；12周时，模型组小鼠血清抗dsDNA抗体阳性率为50%，而抗体干预组未检出，模型组ANA的阳性率为90%，抗体干预组为40%，且荧光面积和荧光亮度均下降；12周时，模型组100%的小鼠出现蛋白尿，尿蛋白含量为（++~++++），而抗体干预组12周时仅有30%的小鼠出现蛋白尿，尿蛋白含量为（+~++）；HE染色镜下观察,模型组肾小球肿胀，有淋巴细胞浸润及新月体生成，而抗体干预组仅有部分出现肾小球体积轻度增大，肾小球囊腔厚薄略微不均一，有少量炎性细胞浸润；直接免疫荧光法可见模型组肾小球血管襻有大量IC沉积，抗体干预组的肾小球部位也可见少量荧光，荧光面积和荧光亮度都弱于模型组；透射电镜下可见模型组小鼠肾基底膜节段性增厚，大量电子致密物沉积，而抗体干预组基底膜厚度较为均匀，仅有少量电子致密物。 结论：B7-1人-鼠嵌合抗体可通过阻断或削弱B7/CD28信号通路，抑制免疫细胞的活化，减少自身抗体和IC生成，逆转狼疮肾炎的病理损伤，提示该类特异性抗体对此类疾患具有潜在的防治作用。