肝脏是人体最重要的脏器之一，其负责多种生化功能。由各种急性肝损害病情恶化所引起的急性肝衰竭是严重危及人类生命的疾病。目前临床上治疗急性肝功能衰竭的肝功能重建途径主要有：同位肝移植、生物人工肝技术以及肝细胞移植。由于肝细胞移植具有特殊的优点，其研究成为目前最为活跃、前景最为诱人的一个热点，应用前景非常广阔。但是，它仍有很多问题需要解决，主要包括：细胞源问题和移植部位的选择。 我们研究组前期工作在国家自然科学基金(30170473)的资助下探索了肝脏干细胞的激活与分化和肝损伤之间的关系，证明了受损肝脏内存在有与干细胞的激活、分化相关的“信号分子”。并运用肝损伤动物模型的实验血清及肝组织萃取物成功地从骨髓干细胞诱导出了能够表达白蛋白的肝细胞样细胞，在成体干细胞的体外诱导分化方面取得了重要进展。然而，这些体外诱导的细胞虽然已经具备了肝细胞的分子表达特征，但在体内能否长期存活并继续保持肝细胞的特征?能否发挥肝细胞的功能作用，并对受损肝脏的功能起到一定的代偿作用?能否用作肝细胞移植和生物人工肝技术的细胞源?要回答这些问题，还需要进一步的体内实验研究。 基于目前的研究现状以及本研究组前期的工作结果，本实验拟采用体外诱导的不同分化阶段的肝细胞样细胞通过脾脏和腹股沟静脉两种方法进行体内移植，以观察移植细胞在体内的存活能力、分子表达特征以及对不同程度肝功能衰竭的代偿能力和不同移植途径对肝功能重建的影响。通过本实验不仅可以揭示体外诱导细胞植入体内后的表型特征及其功能特征的变化规律，也为肝损伤的细胞移植代偿治疗提供理论上的依据和技术上的准备，近一步为将来临床应用提供理论和实验依据。实验方法采用3％2-AAF/CCl4急性肝损伤模型雌性SD大鼠的肝组织匀浆诱导贴壁法分离培养同种雄性大鼠骨髓问质干细胞(BMSCs)，以BST-1、M2-PK、GST-P、Albumin等为分子标志，采用RT-PCR技术检测BMSCs的分化状态。以D-氨基半乳糖胺(D-gal)作为肝脏毒剂，构建雌性SD大鼠急性肝衰竭模型。以病理形态学和多项血生化指标综合评估肝功能损伤的状态，确定模型构建的最优方案。以此为基础，通过脾内和腹股沟静脉两种途径植入不同分化阶段的雄性SD大鼠的BMSCs。然后，以sry基因为分子标志，采用PCR技术检测植入细胞在受体内的定位和存活状态，结合多项血生化指标对两种不同的植入途径及不同分化阶段的BMSCs对肝功能重建的影响进行综合评估。 实验结果①未诱导BMSCs仅表达髓系来源标志BST-1，诱导11天的细胞表达BST-1和幼稚肝细胞标志GST-P及M2-PK，诱导20天的细胞BST-1、GST-P和M2-PK的表达消失，成熟肝细胞标志Albumin的表达出现，与前期研究结果相符。②不同剂量的D-gal可导致不同程度的肝损伤，而1.4g/kg剂量一次性腹腔注射较好地模拟了急性肝衰竭的病理生理改变且稳定性较好。③不同分化阶段的BMSCs经移植后可以显著改善肝衰竭大鼠的肝功能，降低死亡率，且BMSCs经诱导表达成熟肝细胞标志的肝细胞样细胞的作用较未诱导的BMSCs和BMSCs经诱导表达幼稚肝细胞标志肝细胞样细胞更强大。④同一种细胞经脾和腹股沟静脉移植对改善肝功能的程度无显著性差异，但经腹股沟静脉较经脾移植操作简便，死亡率较低。⑤移植后7天～30天在各细胞移植组大鼠肝脏内均能检测到sry基因阳性细胞的存在，而相应对照组未能检测到sry基因阳性细胞的存在。 结论1.D-gal1.4g/kg一次性腹腔注射所构建的SD大鼠急性肝衰竭模型，从形态学上、血清学上都能反映急性肝衰竭的状态和强度，其自然恢复时间为1周左右，可以此作为实验的窗口，观察移植细胞对急性肝衰竭大鼠的治疗作用。 2.BMSCs体外诱导至不同分化阶段的肝细胞样细胞和未诱导的BMSCs经腹股沟静脉移植和脾内移植都能在受体体内存活至少一月，但从实验研究或临床角度来说，经腹股沟静脉移植操作简便易行，死亡率较低，可作为细胞移植的首选途径。 3.BMSCs体外诱导至成熟阶段的肝细胞样细胞可以显著改善肝衰竭大鼠的肝功能，降低死亡率；未诱导的BMSCs以及BMSCs体外诱导至幼稚阶段的肝细胞样细胞经脾和腹股沟静脉移植对改善肝衰竭大鼠的肝功能和降低死亡率亦有一定的作用，且改善的程度二者之间无显著性差别，但与诱导至成熟阶段的肝细胞样细胞比较它们改善的程度较小，故诱导成熟的肝细胞样细胞作为移植细胞源可能更理想。 4.从以上实验可以看出我们体外诱导的BMSCs具备HCT种子细胞的基本条件，通过体内移植可以起到有效作用，并在体内存活，其可能作为治疗肝功能衰竭进行细胞移植的一个理想细胞源。