论文部分内容阅读
ω-芋螺毒素（ω-CTX MⅦA）是由僧袍芋螺分泌的含25个氨基酸多肽,属于ω-芋螺毒素的一种。由于它可高效阻断N型电压敏感性钙离子通道,因此被作为镇痛剂,并且在神经疾病治疗和离子通道亚型鉴定等方面有重要的应用,已经成为目前多肽化学、分子生物学和药物药理学等领域的研究热点。芋螺毒素毒性较强,人类被芋螺等叮咬后会出现惊厥、颤动、神经性麻木、丧失活动能力等症状,严重时会出现死亡。鉴于芋螺毒素的上述特点,开发基于抗ω-CTX MⅦA单克隆抗体的快速简便的免疫检测方法具有重要意义。本研究主要通过制备高亲和力、高特异性的抗ω-CTX MⅦA单克隆抗体,并且利用该抗体建立其免疫学检测方法,包括酶联免疫吸附试验法和胶体金试纸条法,以实现对ω-CTX MⅦA毒素的快速检测。表达纯化融合蛋白GST-ω-CTX MⅦA作为小鼠免疫用抗原,并以融合蛋白TRX-ω-CTX MⅦA作为检测用抗原,进行尾部血清效价的检测。当血清效价超过1:8000时,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞用化学方法融合,通过多轮的筛选和亚克隆,最终得到一株可稳定分泌高亲和力抗ω-CTX MⅦA的单克隆抗体细胞株,将其命名为2E5。该单克隆抗体亚型为IgG1。通过小鼠体内诱生法产生腹水,采用Protein G亲和层析介质法纯化腹水并用SDS-PAGE电泳分析。纯化的IgG抗体特异性良好并且亲和力常数为2.79×109L/mol。icELISA结果显示半抑制率IC50=1.306μg/mL,能检测到ω-CTX MⅦA 最低浓度为 0.138 μg/mL,并且线性检测范围是0.198～7.219 μg/mL。在模拟样品检测中,批内和批间的变异系数分别为2.59%和5.42%,表明此检测方法具有较高的重复性和稳定性,能够以此抗体建立稳定的ELISA检测方法,并且可以应用于实际样品的快速检测当中。用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,并与纯化的ω-CTX MⅦA单克隆抗体进行标记。纯化后的金标抗体喷涂于金标结合垫,制备的完全抗原TRX-ω-CTX MⅦA包被在NC膜T线位置,羊抗鼠IgG包被在NC膜C线位置,组装成胶体金试纸条。将其用于ω-CTX MⅦA标品的检测,其最低检测限为1μg/mL,并且特异性良好,无交叉反应。本研究制备的单克隆抗体既可用于ELISA法对ω-CTX MⅦA的检测,也可用于胶体金试纸条的制备,这对实现实际样品中ω-CTX MⅦA的快速检测具有重要意义。