研究背景动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是一类重要的动脉硬化血管病变,其病变从动脉内膜开始,先后出现脂质积聚、出血和血栓形成、纤维组织增生和钙质沉着、动脉中层退变和钙化。免疫炎症反应、氧化应激反应、血流动力改变等多个方面影响AS发生发展,机制尚未完全明确。探讨影响AS发生发展的分子机制,明确潜在治疗靶点,对于早期干预斑块形成及稳定易损斑块、降低不良心血管事件的发生具有重大意义。循环中高血压、高血脂等各种危险因素均能损伤内皮细胞,造成内皮细胞功能失调,触发早期斑块形成;增加炎症氧化应激反应,促进斑块进展,导致内皮细胞凋亡,新生血管及血栓形成,增加斑块的不稳定性。既往发现内质网应激（ERS）参与AS发生发展。DKK是一种动物进化中保守的分泌型糖蛋白,包含四个成员（DKK1-4）,其中DKK1、2、4参与调控Wnt信号通路。DKK1蛋白通过自分泌与旁分泌在生物体内发挥作用。一方面,DKK1与LRP6的高亲和力致使所有Wnts分子难以与之结合,拮抗下游经典Wnt通路,影响下游基因表达。另一方面,在上皮细胞中发现DKK1结合Ⅱ型跨膜细胞骨架相关蛋白4,CKAP4（P63）,激活PI3K/AKT通路。肿瘤细胞的研究中发现Wingless及Wnt5a可诱导ERS,提示ERS与Wnt通路相关。DKK1在心血管疾病中的研究受到关注。研究发现DKK1通过增加内皮和血小板之间的炎症反应促进AS。糖尿病、急性卒中及冠心病患者血清DKK1表达增加。本课题组前期发现外周血DKK1反映冠状动脉粥样硬化的严重程度及不稳定状态,可作为再发不良心血管事件的独立预测指标。病理剪切力通过上调血管内皮细胞DKK1促AS形成。目前,DKK1在早期及进展期AS斑块中的调控作用及分子机制尚未深入研究。DKK1是否通过内皮细胞分泌,是否促进斑块凋亡与内质网应激,损伤血管内皮功能,亦未见报道。研究目的1.明确DKK1在ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块发生、发展中对斑块的组织形态及易损性的作用;2.探讨DKK1对动脉粥样硬化斑块炎症、凋亡、内质网应激的影响;3.观察DKK1在斑块内的主要细胞定位及对内皮细胞功能改变。研究方法1.Lenti-shDKK1 与 Lenti-DKK1 慢病毒的构建应用慢病毒载体pGLV3/H1/GFP+Puro（pGLV3）及LV5分别构建小鼠DKK1沉默慢病毒及过表达慢病毒。应用慢病毒载体LV5构建人DKK1过表达慢病毒。2.动物分组180只8周龄ApoE-/-雄性小鼠,2周适应性饮食后,高脂喂养,分3组:高脂4周组（n=60）,高脂8周组（n=60）,高脂12周组（n=60）。每组分四个亚组,于取材前四周行尾静脉注射:（1）NS组（n=15）:200μl生理盐水;（2）GFP组（n=15）:200μl 4×108TU 的 Lenti-GFP;（3）Lenti-shDKK1 组（n=15）:200μl 4×108TU 的 Lenti-shDKK1病毒;（4）Lenti-DKK1 组（n=15）:200μl 4×108TU 的Lenti-DKK1病毒。2周后检测慢病毒转染效率,4周后取材。3.动物取材小鼠麻醉,取血清,检测TG、TC、LDL-C、HDL-C及DKK1水平。取材主动脉全长,心肝脾肾肺,根据需要选择甲醛固定或者液氮（-80℃）保存。4%甲醛固定主动脉根24h后,OCT包埋,5μm连续切片。4.组织蛋白提取取主动脉弓至胸主动脉段,每20mg组织使用100μlRIPA,剪碎消化,离心取上清,煮沸变性。5.蛋白质印迹法（Western Blot,WB）蛋白点样10μl/孔,电泳,转膜,孵育一抗4℃过夜,洗膜,二抗孵育后化学发光,曝光留图并分析条带灰度值。6.大体油红0染色大体显微镜下剥净血管外膜,纵向剖开。室温浸泡油红O染液2h,热水浸泡血管脱浮色,压制展平拍照。7.主动脉根部斑块冰冻切片常规染色HE染色观察斑块大小及形态,油红O染色检测脂质含量,天狼猩红染色检测胶原纤维含量,免疫组化染色检测巨噬细胞（MOMA-2）、平滑肌（α-SMA）的含量,Masson染色观察纤维帽厚度,计算易损指数。免疫组化染色检测炎症因子（TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6）、粘附分子（ICAM1、VCAM1）、基质金属蛋白酶（MMP2、MMP9）、凋亡指标（Bcl-2,Bax,cleaved caspase-3）及内质网应激凋亡指标（caspase-12）的表达情况。8.免疫荧光双色染色共定位观察DKK1在内皮细胞（Endomucin）、巨噬细胞（MOMA-2）内的分布。固定,封闭,混合两种一抗,4℃孵育过夜,混合对应的荧光二抗,37℃孵箱避光孵育1h,DAPI染核,防淬灭剂封片并拍照。9.细胞共培养Transwell小室铺板,上室铺种人脐静脉内皮细胞,下室分别铺种人脐静脉内皮细胞、人主动脉平滑肌及人巨噬细胞。Lenti-GFP-DKK1病毒转染上层细胞,8h后换液与下室细胞共培养,72h后拍照。10.免疫荧光+TUNEL共定位染色免疫荧光染色,Endomucin一抗及荧光二抗（TRITC）孵育,TUNEL染色（固定,TdT酶反应,抗地高辛结合物反应）,复染DAPI,防淬灭剂封片并拍照。11.动脉环实验制作主动脉环,置于压力感应装置上,预刺激后,1 0μmol/L NE及10-3～10-5μmol/LAch分别刺激血管,PowerLab数据采集分析系统记录张力值,计算最大舒张百分比。12.ELISA采集人空腹外周血5ml,分离血清,应用DKK1、ADMA及ET-1的ELISA试剂盒分别检测DKK1、ADMA、ET-1浓度。13.统计分析实验数据均以均数±标准差表示,应用SPSS 16.0软件分析数据。非配对t检验用于两样本间比较,多样本间比较应用ANOVA单因素方差分析及Bonferroni post-hoc分析,两个变量间相关性分析使用Pearson相关分析,P<0.05为具有显著统计学差异。研究结果1.实验动物一般情况高脂4周、8周、12周的四个亚组（NS组、GFP组、shDKK1组、DKK1过表达组）的ApoE-/-小鼠的体重及血清TC、TG、LDL-C和HDL-C均无显著统计学差异。说明DKK1不影响ApoE-/-小鼠的血脂及体重。2.慢病毒转染效率及表达效率检测高脂喂养12周慢病毒转染2周后取NS组、LV3空病毒组、LV5空病毒组各两只。与NS组相比,GFP组斑块内均有较强的绿色荧光,表明转染有效。高脂喂养12周慢病毒转染4周后取材主动脉。与NS组、GFP组相比,shDKK1组DKK1蛋白表达水平降低（P<0.05）,DKK1组DKK1蛋白表达增加（P<0.05）。与NS组、GFP组相比,shDKK1组DKK1血清水平明显下调（P<0.05）,DKK1组DKK1血清水平上调（P<0.05）。说明沉默或过表达有效。3.DKK1增加主动脉根部斑块大小及易损性大体油红O染色及HE染色,高脂4周、8周及12周组中均发现与NS组、GFP组相比,shDKK1组斑块面积减小（P<0.05）,DKK1组斑块面积增加（P<0.05）。与NS组、GFP组相比,shDKK1组斑块平滑肌含量增加,巨噬细胞及脂质含量减少,易损指数降低,纤维帽增厚（P<0.05）;DKK1组斑块平滑肌含量减少,巨噬细胞及脂质含量增加,易损指数增加,纤维帽变薄（P<0.05）。高脂4周及8周时,斑块内胶原含量四个亚组间无差异（P>0.05）,高脂12周时,与NS组、GFP组相比,shDKK1组斑块胶原含量增加,DKK1组斑块胶原含量减少。4.DKK1上调主动脉根部斑块内炎症因子表达。高脂4周组中,与NS组、GFP组相比,shDKK1组斑块内MMP2、MMP9表达减少（P<0.05）,DKK1组斑块内MMP2、MMP9表达增加（P<0.05）;四组间粘附因子ICAM1、VCAM1及炎症因子TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6无显著性差异（P>0.05）。高脂8周组中,与NS组、GFP组相比,shDKK1组斑块中MMP2、MMP9 及炎症因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 表达减少（P<0.05）,DKK1 组斑块中 MMP2、MMP9 及炎症因子 TNF-α、IL-1 β、IL-6 表达增加（P<0.05）;ICAM 1、VCAM1及MCP-1四组间未见表达差异（P>0.05）。高脂12周组中,与NS组、GFP组相比,shDKK1组斑块内ICAM1、VCAM1、MMP2、MMP9及炎症因子TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6表达均减少（P<0.05）;DKK1组斑块内上述分子表达均增加（P<0.05）。5.DKK1促进主动脉根部斑块内凋亡及内质网应激高脂4周、8周、12周时均发现,与NS组、GFP组相比,shDKK1组斑块凋亡指标Bax、cleaved caspase-3及ERS指标caspase-12表达减少,Bcl-2表达增加（P<0.05）;DKK1 组斑块凋亡指标 Bax,cleaved caspase-3 及 ERS 指标 caspase-12表达增加,Bcl-2表达减少（P<0.05）。6.DKK1在斑块内表达主要定位内皮细胞并存在细胞间交互通讯取12周高脂-NS组行主动脉根部斑块共定位染色,发现DKK1表达位置与内皮细胞位置一致,而巨噬细胞定位未见大量DKK1表达。体外Lenti-GFP-DKK1转染内皮细胞,并与内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞共培养,发现共培养细胞内均出现GFP荧光。DKK1参与ox-LDL诱导的巨噬细胞的炎症反应,外源性DKK1抑制平滑肌细胞的增殖。7.DKK1损伤血管内皮舒张功能取高脂4周组行血管舒张实验。与GFP组对比,shDKK1组最大舒张百分比增加（P<0.05）;DKK1组最大舒张百分比降低（P<0.05）。8.DKK1促进动脉粥样硬化斑块内凋亡,主要为内皮细胞凋亡取高脂12周组行主动脉根部斑块TUNEL与细胞共定位染色,与NS组、GFP组相比,shDKK1组小鼠斑块内凋亡减少（P<0.05）;DKK1组小鼠斑块内凋亡增加（P<0.05）,且凋亡主要发生在内皮细胞。9.人血清DKK1与内皮细胞功能失调相关分子ADMA、ET-1正相关检测人正常组、不稳定心绞痛组及急性心肌梗死组血清,发现急性心梗患者DKK1、ADMA、ET-1 水平增加（P<0.05）,DKK1 与 ADMA、ET-1 正相关（P<0.05）。结论1.DKK1参与动脉粥样硬化发生、斑块易损性、血管舒张功能调节;2.DKK1参与动脉粥样硬化发展、细胞凋亡、内质网应激的调节;3.DKK1主要由内皮细胞表达,可通过自分泌、旁分泌发挥作用。研究背景动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是心血管疾病的重要病理基础之一。ox-LDL通过胞膜上LOX-1等清道夫受体摄取,激活内质网应激、Wnt/β-catenin等多种信号通路,最终改变内皮舒张功能、增加单核细胞黏附、促进内皮细胞功能失调及老化,推动AS发生发展。ox-LDL作为AS的始动激活物质,明确其在内皮细胞中的作用机制,为寻找临床干预AS的潜在靶点意义重大。在第一部分,我们发现,沉默DKK1延缓斑块的发生发展,稳定斑块,过表达DKK1加速斑块的发生发展,促进斑块不稳定。同时发现内皮细胞为斑块内DKK1的主要表达位置,DKK1调控AS早期血管内皮舒张功能及进展期细胞凋亡及内质网应激。以上结果证实内皮细胞DKK1在AS各阶段发挥作用。因此,本研究选择内皮细胞深入研究DKK1调控内皮细胞功能的分子机制。DKK1蛋白,是DKK家族的一种分泌性糖蛋白。一方面,在多种肿瘤细胞功能学研究中发现DKK1拮抗经典Wnt/β-catenin通路,促进LRP6内吞降解,上调PCP/JNK非经典Wnt通路、JNK通路、ROS、p53、p21、NF-KB等分子,影响细胞增殖迁移凋亡及炎症反应。另一方面,在上皮细胞中发现,DKK1与ⅡI型跨膜细胞骨架相关蛋白4即CKAP4（P63）结合,激活PI3K/AKT,促进增殖。但内皮细胞中ox-LDL是否调节DKK1表达,DKK1作为Wnt/β-catenin的拮抗剂,是否参与ox-LDL对内皮细胞内质网应激及凋亡的调节,是否影响内皮细胞生物学功能,均尚未见机制报道。研究目的1.明确在ox-LDL刺激下HUVECs内DKX1的表达规律;2.探讨DKK1是否参与ox-LDL诱导的HUVECs凋亡、增殖迁移及小管新生等改变;3.探讨内质网应激通路及Wnt通路在DKK1调控HUVECs凋亡中的作用关系。研究方法1.时间梯度及浓度梯度干预4-8代HUVECs给予ox-LDL 150μg/ml的0、0.5、1、3、6、12h刺激,确定ox-LDL影响DKX1的时间关系,收集细胞及细胞上清,利用qPCR、Western Blot及ELISA观察DKX1mRNA、蛋白及分泌水平表达。确定ox-LDL刺激DKK1的合适时间后,选择0、25、50、100、150、200μg/ml的ox-LDL刺激HUVECs 6h,明确ox-LDL刺激DKK1表达的合适浓度。选择适宜的刺激时间及浓度,用于后续研究。2.ELISA检测细胞最后一次处理前换用无血清培养基,刺激结束后,收集上清液,1000g4℃离心20min,采用ELISA试剂盒（R&D Systems）检测细胞上清DKK1浓度。3.细胞转染利用 lip3000 转染 DKK1、CHOP、IRE1A、ATF6 以及 NC siRNA,依照实验分组给予刺激,转染24-48h收集细胞,提取蛋白,Western Blot检测表达。4.实时荧光定量PCRTrizol法提取总RNA,TAKARA逆转录试剂盒行RT-PCR,SYBR Green荧光定量试剂盒进行qPCR,引物由上海吉玛生物公司合成。5.蛋白质印迹法（Western Blot,WB）利用蛋白裂解液提取细胞总蛋白,4℃14000rpm离心5min,取上清,加入5×蛋白上样缓冲液,99℃5min蛋白变性。点样,电泳,转膜,封闭,一抗孵育,洗膜,二抗孵育,化学发光。6.细胞爬片双蒸水（80ml）与冰醋酸（92.2μl）混匀高压,加入1ml鼠尾胶原混匀以制备胶原。在高压灭菌的载玻片上均匀滴加胶1ml/片,超净台内静置1h,回收胶原,晾干后种板。7.TUNEL法检测细胞凋亡按照TUNEL试剂盒说明书,免疫染色固定液固定、乙醇/乙酸混合液-20℃后固定、TDT酶孵育等步骤,荧光显微镜下观察拍照,计算阳性细胞率。8.PE/7-AAD流式细胞术检测细胞凋亡按照Annexin V PE/7-AAD凋亡检测试剂盒说明书,消化细胞,洗涤离心,每管加入100μl结合底物+5μl PE+5μl 7-AAD,避光孵育15min,上机检测并分析。9.检测DKK1在ox-LDL调节内皮细胞生物学功能中的其他作用转染DKK1 siRNA或NC siRNA,给予ox-LDL刺激6h,采用EdU法检测内皮细胞的增殖;应用细胞划痕实验及Transwell检测内皮细胞的迁移;应用ROS检测内皮细胞活性氧生成;应用基质胶内小管形成实验检测内皮细胞成管能力。10.统计分析采用均数±标准差（mean±SD）表示数据,应用SPSS 16.0软件进行数据统计分析。两样本间比较使用非配对t检验,多样本间比较使用ANOVA单因素方差分析,P<0.05认为存在显著统计学差异。研究结果1.ox-LDL上调HUVECs中DKK1的表达给予不同时间150μg/ml ox-LDL刺激HUVECs。与0h相比,ox-LDL刺激后DKK1 mRNA、蛋白表达及分泌水平均升高（P<0.05）,6小时增加最明显。给予不同浓度的ox-LDL刺激HUVECs 6h。与0μg/ml相比,ox-LDL在150μg/ml及200μg/ml明显上调DKK1 mRNA、蛋白水平及分泌表达（P<0.05）。2.DKK1参与ox-LDL诱导的HUVECs凋亡DKK1 siRNA 转染后,ox-LDL 对 Bax、cleaved caspase-3 水平下调,Bcl-2水平的下调被缓解（P<0.05）。应用TUNEL及PE/7-AAD流式检测,ox-LDL对凋亡细胞比例下调（P<0.05）。3.DKK1参与ox-LDL诱导的HUVECs内质网应激与空白对照组相比,ox-LDL组、rDKK1及ox-LDL组+rDKK1组中内质网应激指标 p-eif2α,CHOP,IRE1α,XBP1s,ATF6,GRP78 水平均上调（P<0.05）。DKK1 siRN A 转染后,ox-LDL 对内质网应激指标 p-eif2α,CHOP,IRE 1 α,XBP1s,ATF6,GRP78水平的上调均被抑制（P<0.05）。4.DKK1通过内质网应激促进HUVECs凋亡4-PBA 或 salubrinal 预处理,或者 CHOP siRNA、IRE1α siRNA 及 ATF6 siRNA转染,rDKK1对Bax、cleaved caspase-3上调被缓解,Bcl-2的下调亦被恢复（P<0.05）,TUNEL及PE/7-AAD流式检测凋亡细胞下调（P<0.05）。但ATF6 siRNA 转染后,Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2 表达无统计学差异（P>0.05）。Lenti-DKK1转染HUVECs48h,检测蛋白表达,结果一致（P<0.05）。5.DKK1通过上调JNK促进HUVECs中内质网应激CHOP、IRE1 α的表达及凋亡DKK1 siRNA 转染后 p-JNK、p-ERK1/2、p-P38 均表达下调（P<0.05）。Lenti-DKK1 转染后 p-JNK、p-ERK、p-P38 均表达上调（P<0.05）。MAPK 通路抑制剂 SP600125,SB203580 及 U0126 预处理后,Lenti-DKK1 对 Bax、cleaved caspase-3、CHOP、IRE1α及 GRP78 的上调被 SP600125 抑制,Bcl-2 的下调被SP600125 恢复（P<0.05）;SB203580 及 U0126 对 Bax/Bcl-2 无影响（P>0.05）。6.DKK1通过拮抗wnt/β-catenin上调IRE1α促进HUVECs凋亡IM-12 预处理后,Lenti-DKK1 对 GRP78、IRE1α、Bax、cleaved caspase-3上调被缓解（P<0.05）,对Bcl-2的下调抑制（P<0.05）,对CHOP、JNK的表达无影响（P>0.05）。FH535 预处理后,DKK1 siRNA 对 GRP78、IRE1α、Bax、cleaved caspase-3的下调被抑制（P<0.05）,对Bcl-2的上调被缓解（P<0.05）,对CHOP、JNK的表达无影响（P>0.05）。7.DKK1参与ox-LDL诱导的HUVECs迁移、小管新生及ROS生成,而不影响HUVECs增殖转染DKK1 siRNA,下调HUVECs的迁移、小管新生及ROS生成（P<0.05）,对增殖无影响（P>0.05）。结论（1）ox-LDL上调DKK1表达呈浓度依赖性和时间依赖性;（2）DKK1通过JNK/内质网应激及Wnt/β-catenin/IRE1 α共同调控HUVECs的凋亡;（3）DKK1参与ox-LDL诱导的HUVECs凋亡、迁移、小管新生及ROS生成。研究背景ox-LDL经LOX等受体识别结合,参与内皮细胞的免疫炎症反应、氧化应激、增殖凋亡等多个环节,诱导内皮细胞功能失调,成为动脉粥样硬化（AS）的启动环节。近年来发现,ox-LDL可以在转录、转录后、翻译后等水平调节特定基因的表达,调节血管内皮功能,影响AS的发生发展。DKK1蛋白,是DKK家族的一种分泌性糖蛋白。目前发现DKK1存在组蛋白修饰、转录、转录后、翻译后（磷酸化,糖基化等）多个水平的调控。但ox-LDL上调内皮细胞中DKK1的表达,其调控机制仍需进一步探究。Ets-1是Ets家族成员之一（E26 transformation-specific）,拥有一个保守结构域（EBS）,识别（GGAA/T）。通过自身结构变化、转录因子及miRNA干预、辅因子结合等方式影响Ets-1活性,在不同细胞的具体机制有所不同。Ets-1在内皮细胞中发挥促进血管新生、促进细胞迁移、促炎、诱导凋亡等多种功能。我们应用ALGGEN-PROMO及JASPAR软件发现Ets-1在DKK1启动子区有多个预测结合位点,DKK1是Ets-1理论上的靶基因。Ets-1能否通过调控DKK1影响内皮细胞相关功能?目前尚无相关报道。miRNA是一类非编码单链小RNA分子,特异地结合于靶基因mRNA的3’端非翻译区（3’-UTR）,在转录后水平抑制基因表达。miRNA在AS发生发展及内皮细胞功能中均发挥重要作用。不同细胞中miRNA的调控机制可能不同。通过MicroRNA.org.、Starbase、Targetscan 等软件预测 miR33a-5p 能特异的与 Ets-1及DKK1的3’-UTR结合,Ets-1及DKK1均是miR33a-5p理论上的靶基因。目前关于miR33a-5p的研究较少,miR33a-5p可能与巨噬细胞脂质代谢、抑制肿瘤细胞增殖有关。既往糖尿病心肌病研究中发现,DKK1受miR217,miR33a,miR33b,miR103a,miR93及miR106a调控。但内皮细胞中miR33a-5p的作用机制,miR33a-5p是否调节Ets-1与DKK1表达均尚不清楚。研究目的1.探究Ets-1在ox-LDL上调HUVECs中DKK1表达的作用;2.探究miR33a-5p在ox-LDL上调HUVECs中DKK1表达的作用;3.明确CBP/P300及c-jun对HUVECs中DKK1表达的调节作用及其与Ets-1的关系。研究方法1.内皮细胞及293T细胞的培养复苏冻存的4-8代HUVECs、293T细胞,用于实验。HUVECs使用ECM培养基培养,293T细胞使用高糖DMEM（10%FBS）培养。2.质粒构建分别构建含有野生型DKK1 3’-UTR、突变型DKK1 3’-UTR、野生型Ets-13’-UTR、突变型 Ets-1 3’-UTR 的荧光素酶报告基因质粒（pGL3）:pGL3-DKK1-3’-UTR-WT和pGL3-DKK1-3’-UTR-MUT,pGL3-Ets-1-3’-UTR-WT和pGL3-Ets-1-3’-UTR-MUT。分别构建包含DKK1启动子区全长、梯度截短及删除片段的荧光素酶报告基因质粒（pGL3）:PGL3-basic-DKK1 promoter（P0）,PGL3-DKK1 promoter（P1-P9）,PGL3-basic-DKK1 promoter（deletATGGAAT）（P0-del）。构建PCDNA3.1-Ets-1过表达质粒及PCDNA3.1-c-jun过表达质粒,空白载体质粒PCDNA3.1,海肾质粒pRL-TK。3.细胞转染将 NC siRNA、miR33a-5p mimics、miR33a-5p inhibitor、Ets-1 siRNA 或质粒等利用lip3000转染至HUVECs或293T细胞中,分组给予刺激,转染24h-48h后,进行下一步处理。4.实时荧光定量PCR采用Trizol法提取细胞总RNA,应用TAKARA逆转录试剂盒进行RT-PCR,采用SYBR Green荧光定量试剂盒进行qPCR,引物由上海吉玛生物公司合成。5.蛋白质印迹法（Western Blot,WB）蛋白裂解液RIPA提取细胞总蛋白,4℃ 14000rpm离心5min,取上清,加入5×蛋白上样缓冲液混匀,99℃变性5min。点样,电泳,转膜,封闭,一抗孵育,洗膜,二抗孵育,化学发光。6.细胞免疫荧光染色免疫染色固定液固定、0.5%TritonX-100的PBS通透、5%BSA封闭,一抗4℃孵育过夜,洗涤,二抗避光孵育1h,染核、封片,荧光显微镜拍照。7.双荧光素酶报告基因检测质粒转染HUVECs及293T细胞48h后,加入1×裂解缓冲液消化,冻融2次,收集裂解液上清,应用多功能酶标仪,设计加样模板及程序,依次自动加样Luc Buffer Ⅰ 和 Luc Buffer Ⅱ,读取荧光强度。8.凝胶迁移实验（EMSA）核蛋白提取试剂盒提取核蛋白,BCA定量。将野生或突变引物与EMSA试剂盒中试剂混匀,室温孵育30min,行非变性PAGE凝胶电泳及转膜,DNA交联,封闭,化学发光。9.染色质免疫沉淀技术细胞交联,DNA消化剪切,取少量进行酶切检验及浓度检测,余下样品根据分组使用不同抗体4℃旋转孵育过夜,磁珠孵育2h,洗脱解交联,qPCR及琼脂糖凝胶电泳定量分析ChIP富集效率及表达量。10.免疫共沉淀技术使用1 00μl IP裂解液冰上裂解细胞30min,4℃12000g离心30min,加入1μg抗体4℃孵育过夜,加入预处理的Protein A琼脂糖珠4℃孵育4h,3000rpm 4℃3min离心,洗涤沉淀,弃上清,加入1×蛋白上样缓冲液,99℃ 10min变性,行WB检测。11.细胞实验分组（1）为检测miR33a-5p在ox-LDL诱导的HUVECs生物学功能改变中的作用,分以下六组:①NC组,②NC+ox-LDL组,③miR33a-5p mimics组,④miR33a-5p mimics+ox-LDL 组,⑤NCI组,⑥miR33a-5p inhibitor 组;（2）为检测miR33a-5p是否通过调节Ets-1在ox-LDL诱导的HUVECs生物学功能改变中发挥作用,分以下八组:①NC组,②miR33a-5p mimics组,③NC+Ets-1重组蛋白组,②miR33a-5p mimics+Ets-1重组蛋白组;⑤NCI组,⑥miR33a-5p inhibitor 组,⑦NCI+si-Ets-1组,⑧miR33a-5p inhibitor+si-Ets-1 组;（3）为检测Ets-1是否通过调节DKK1调节HUVECs生物学功能,分以下几组:①NC组,②NC+Ets-1重组蛋白组,③si-DKK1组,④si-DKK1+Ets-1重组蛋白组;（4）为检测CBP/P300是否参与Ets-1对HUVECs生物学功能的调节,分以下几组:①DMSO组,②CBP/P300 inhibitor组,③DMSO+Ets-1重组蛋白组,④CBP/P300inhibitor+Ets-1 重组蛋白组;采用TUNEL法检测HUVECs的凋亡;应用细胞划痕实验及Transwell检测HUVECs的迁移;应用基质胶内小管形成实验检测HUVECs成管能力。12.统计分析以均数±标准差表示实验数据,应用SPSS 16.0软件进行数据统计分析。非配对t检验用于两样本间比较,多样本间比较运用ANOVA单因素方差分析,P<0.05认为存在显著统计学差异。研究结果1.Ets-1参与ox-LDL对HUVECs中DKK1的上调给予ox-LDL刺激,与0h组相比,1,3,6h组HUVECs中Ets-1蛋白及mRNA表达上调。ox-LDL刺激后,Ets-1表达量增加且入核增加。siRNA转染干扰Ets-1表达后,ox-LDL对HUVECs中DKK1的表达上调被抑制。2.Ets-1明显增强DKK1启动子活性HUVECs共转染pRL-TK及P0 48h后,应用双荧光素酶基因报告（DLR）发现,ox-LDL显著增强DKK1转录活性（P<0.05）。P0+pRL-TK分别与PCDNA3.1、PCDNA3.1-Ets-1、NC siRNA,Ets-1 siRNA 共转染 293T 细胞 48h 后,DLR 显示,Ets-1增强DKK1转录活性（P<0.05）,Ets-1 siRNA降低DKK1转录活性（P<0.05）。pRL-TK+PCDNA3.1+P0（对照组）,pRL-TK+PCDNA3.1-Ets-1+P0-P9（P0组-P9组）共转染293T细胞48h后,DLR检测,相比对照组,P0组DKK1转录活性增强（P<0.05）;与P0组相比,P1-P9组DKK1转录活性降低（P<0.05）。同时应用EMSA及ChIP实验,提示DKK1启动子区-2006～-2000片段（EBS2）与Ets-1的结合对DKX1转录活性影响最大（P<0.05）。3.c-jun参与ox-LDL对HUVECs中DKK1的转录活性上调给予ox-LDL刺激,与0h组相比,1、3、6h组c-jun、c-fos蛋內及mRNA表达上调（P<0.05）。siRNA转染干扰c-jun及c-fos表达,发现ox-LDL对DKX1均下调（P<0.05）。ox-LDL刺激后,c-jun表达增加且入核增加,c-fos核内表达变化不明显。P0+pRL-TK 分别与 NC siRNA,c-jun siRNA 共转染 293T 细胞 48h 后,DLR检测 c-jun siRNA 降低 DKK1 转录活性（P<0.05）。pRL-TK+PCDNA3.1+P0（对照组）,pRL-TK+PCDNA3.1-c-jun+P0-P9（P0组-P9 组）共转染 293T 细胞 48h后,DLR检测,与对照组相比,P0组DKK1转录活性增强（P<0.05）;与P0组相比,P1组-P9组DKK1转录活性降低（P<0.05）。4.CBP/P300辅助Ets-1及c-jun参与ox-LDL对DKK1转录活性的上调给予Ets-1重组蛋白刺激HUVECs,与空白对照组相比,CBP/P300抑制剂处理组DKK1表达下调（P<0.05）。Co-IP检测发现CBP、c-jun与Ets-1三者间均存在蛋白间相互作用（P<0.05）。P0+pRL-TK共转染293T细胞48h,给予CBP/P300抑制剂预处理12h后,DLR显示,CBP/P300抑制剂下调DKK1转录活性（P<0.05）。pRL-TK+P0（对照组）、pRL-TK+P0+PCDNA3.1-Ets-1（Ets-1 组）、pRL-TK+P0+PCDNA3.1-c-jun（c-jun 组）、pRL-TK+P0+PCDNA3.1-Ets-1+PCDNA 3.1-c-jun（0.5μg,1μg,1.5μg）（共转染1组,2组,3组）,各组分别共转染293T细胞48h后,DLR检测,与对照组相比,c-jun组及Ets-1组DKK1转录活性增强（P<0.05）;与Ets-1组相比,共转染组DKK1转录活性增强,且随c-jun质粒的浓度增加而增大（P<0.05）。结果提示c-jun辅助Ets-1增强DKK1转录活性。分为 P0,P0-del,P0+PCDNA3.1-c-jun,P0-del+PCDNA3.1-c-jun 四组转染 293T细胞,DLR检测,与P0组相比,c-jun提高DKK1转录活性（P<0.05）,与P0+PCDNA3.1-c-jun 组相比,P0-del+PCDNA3.1-c-jun 组转录活性降低（P<0.05）。结果提示Ets-1结合位点删除后,c-jun对DKK1转录活性的影响减弱。5.miR33a-5p 抑制 ox-LDL 对 HUVECs 中 DKK1、Ets-1 的上调给予ox-LDL刺激HUVECs,与0h组相比,1,3,6h组miR33a-5p表达下调。Dicer 酶 siRNA 转染后,DKK1 及 Ets-1 表达增加。miR33a-5p mimics 转染后,ox-LDL 对 DKK1、Ets-1 下调;miR33a-5p inhibitor 上调 DKK1、Ets-1 的表达。DLR检测显示,miR33a-5p可显著降低pGL3-Ets-1-3’-UTR-WT荧光素酶活性（P<0.05）,而并不降低pGL3-DKK1-3’-UTR-WT荧光素酶活性（P>0.05）。结果提示miR33a-5p直接结合Ets-1 3’-UTR下调Ets-1表达,而不直接结合DKK13’-UTR。6.miR33a-5p/Ets-1/DKK1参与ox-LDL诱导的HUVECs的凋亡、迁移及小管新生与 ox-LDL 组相比,miR33a-5p mimics+ox-LDL 组 HUVECs 凋亡、迁移、小管新生减少（P<0.05）;与NCI组相比,miR33a-5p inhibitor组HUVECs凋亡、迁移、小管新生增加（P<0.05）。与 miR33a-5p mimics 组相比,miR33a-5p mimics+Ets-1 组 HUVECs 凋亡、迁移、小管新生增加（P<0.05）;与 miR33a-5p inhibitor 组相比,miR33a-5p inhibitor+Ets-1 siRNA 组 HUVECs 凋亡、迁移、小管新生减少（P<0.05）。与NC组相比,NC+Ets-1组HUVECs凋亡、迁移、小管新生增加（P<0.05）;与 NC+Ets-1 组相比,DKK1 siRNA+Ets-1 组 HUVECs 凋亡、迁移、小管新生减少（P<0.05）。与Ets-1重组蛋白组相比,CBP/P300 inhibitor+Ets-1重组蛋白组HUVECs凋亡、迁移、小管新生减少（P<0.05）。结论1.Ets-1参与ox-LDL对HUVECs中DKK1表达的上调;2.MiR33a-5p/Ets-1、CBP 与 c-jun 共同介导 HUVECs中ox-LDL对DKK1的上调;3.MiR33a-5p/Ets-1/DKK1参与ox-LDL诱导的HUVECs的凋亡、迁移及小管新生。