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大量研究表明,慢性间歇性低压低氧(chronic intermittent hypobaric hypoxia, CIHH)对成年动物具有明显的心脏保护作用,可有效对抗急性缺血/再灌注或急性缺氧/复氧对心肌的损伤、减少心肌梗死面积、限制心肌超微结构的损伤,以及抗心律失常。其机制可能涉及心肌抗氧化能力增强、心肌毛细血管密度及冠脉血流量增加、热休克蛋白表达增加、NO产生增加、抗心肌细胞凋亡、稳定线粒体及钙处理功能、延长心肌动作电位时程及有效不应期等。有研究报道,CIHH对成年大鼠的心脏缺血/再灌注损伤作用与抗钙超载、保持钙稳态有关。但有关CIHH对幼年动物发育心脏钙稳态的作用尚未明了。本研究旨在应用功能学、细胞学、分子生物学及电生理学方法探讨CIHH对幼年发育大鼠钙稳态的作用及其细胞和分子机制。本研究分为四部分:(1)应用Langendorff灌流技术观察CIHH对发育大鼠心脏功能学及梗死面积的保护作用;(2)应用激光共聚焦显微荧光技术,观察CIHH对发育大鼠的心室肌细胞内游离钙浓度的影响;(3)应用分子生物学技术观察CIHH对钙处理蛋白表达的影响;(4)应用全细胞膜片钳方法观察CIHH对发育大鼠心室肌细胞钙离子通道电流和钠钙交换电流的影响,探讨CIHH对钙稳态作用的离子机制。Ⅰ慢性间歇性低压低氧对发育大鼠心脏的保护作用目的:应用Langendorff灌流系统观察CIHH对发育大鼠缺血/再灌注损伤的心脏功能学及梗死面积的影响。方法:雄性新生SD大鼠按年龄及体重相匹配分成四组:28天间歇性低压低氧组(CIHH28)、42天间歇性低压低氧组(CIHH42)和28天对照组(CON28)、42天对照组(CON42)。间歇性低氧处理动物置于低压氧舱,分别接受28天、42天和56天模拟高原3000米(PB = 525 mmHg, PO2 = 108.8 mmHg, 5小时/天)的减压低氧处理。应用langendorff离体心脏灌流技术描记大鼠离体心脏左室功能,给予30分钟全心缺血和60分钟复灌处理。分别记录大鼠心脏缺血前及复灌后不同时间的左室发展压(LVDP)、左室舒张末压(LVEDP)、最大压力变化速率(±LV dp/dt)等心功能参数和冠脉流量(CF)。实验结束后,测定测定其梗死面积。结果:1基础状态下,CIHH大鼠冠脉流量较对照大鼠明显增多,其余心功能参数及梗死面积与对照大鼠无差异。缺血/再灌注导致动物心功能受损、心肌梗死面积增大,但CON与CIHH动物间具有明显差异。CIHH大鼠缺血/再灌注后心脏功能的恢复明显好于对照动物,表现为左心室发展压(LVDP)和左心室最大压力变化速率(±LVdp/dtmax)恢复增加(P<0.05),左心室舒张末压(LVEDP)恢复降低(P<0.05),梗死面积减小(P<0.05)。CIHH42大鼠抗心脏缺血/再灌注损伤作用强于CIHH28大鼠。2 L型钙通道开放剂,Bay K8644 (0.5μM)和肌浆网内钙释放开放剂,ryanodine (10 nM)可取消CIHH的心脏保护作用(P<0.05)。小结: CIHH可增强发育大鼠抗心肌缺血/再灌注损伤的能力,具有明显的心脏保护作用。其保护作用与心肌细胞钙稳态的维持有关,增加外钙内流和内钙释放均可取消其保护作用。Ⅱ慢性间歇性低压低氧对发育大鼠心室肌细胞内游离钙的影响目的:观察CIHH对发育大鼠心室肌细胞内游离钙的影响并探讨其可能机制。方法:雄性新生SD大鼠,根据年龄及体重相匹配分成四组:28天间歇性低压低氧组(CIHH28)、42天间歇性低压低氧组(CIHH42)和28天对照组(CON28)、42天对照组(CON42)。CIHH动物置于低压氧舱,分别接受28天和42天模拟高原3000米(PB = 525 mmHg, PO2 = 108.8 mmHg, 5小时/天)的减压低氧处理。通过酶解法得到单个心室肌细胞,并用Fluo3-AM于37°C负载1小时。在缺血前、模拟缺血以及复灌过程中用激光共聚焦显微镜扫描记录荧光强度及图像。结果:1正常台氏液中,CON和CIHH组心室肌细胞内游离钙无显著差异(P > 0.05),在5min模拟缺血和10min再灌注后,CON组心室肌细胞内游离钙浓度增加,而在CIHH28和CIHH42组减弱心室肌细胞内游离钙浓度增加幅度减少,与相应CON有显著差异(P<0.05)。2 CIHH28和CIHH42的这一效应可被L型钙通道开放剂Bay K8644,肌浆网钙泵抑制剂thapsigargin和PKC抑制剂chelerythrine chloride取消。小结: CIHH可抑制发育大鼠心室肌细胞内游离钙浓度的增加,这一效应可被Bay K8644, thapsigargin和chelerythrine chloride取消,提示CIHH的心脏保护效应可能与抗钙超载和PKC激活有关。Ⅲ慢性间歇性低压低氧对发育大鼠钙处理蛋白表达的影响目的:用Western blot方法研究CIHH对发育大鼠钙处理蛋白表达的影响。方法:雄性新生SD大鼠,按年龄及体重相匹配分成四组:28天间歇性低压低氧组(CIHH28)、42天间歇性低压低氧组(CIHH42)和28天对照组(CON28)、42天对照组(CON42)。CIHH动物置于低压氧舱,分别接受28天和42天模拟高原3000米(PB = 525 mmHg, PO2 = 108.8 mmHg, 5小时/天)的减压低氧处理。组织匀浆后提取肌浆网和肌膜蛋白。用Western blot方法检测I/R时钠钙交换体(NCX1),Ryanodine受体(RyR2)和肌浆网钙泵(SERCA2)蛋白的表达。结果:基础状态下,各组大鼠心肌NCX1, RyR2和SERCA2蛋白表达无明显差异(P>0.05)。在模拟缺血条件下,CON28和CON42大鼠心肌NCX1, RyR2和SERCA2蛋白表达明显减少(P<0.05),而CIHH28和CIHH42大鼠心肌的NCX1, RyR2和SERCA2蛋白表达无明显变化(P>0.05)。小结: CIHH可对抗缺血/再灌注对发育大鼠心肌NCX1、RyR2和SERCA2蛋白表达的抑制,而发挥抗缺血/再灌注钙超载作用。IV慢性间歇性低压低氧对发育大鼠L型钙电流及钠钙交换电流的影响目的:用全细胞膜片钳技术研究CIHH对发育大鼠L型钙电流(ICaL)及钠钙交换电流(INa/Ca)的影响,探讨CIHH心脏保护及抗钙超载的离子机制。方法:雄性新生SD大鼠,按年龄及体重相匹配分成四组:28天间歇性低压低氧组(CIHH28)、42天间歇性低压低氧组(CIHH42)和28天对照组(CON28)、42天对照组(CON42)。CIHH动物置于低压氧舱,分别接受28天和42天模拟高原3000米(PB = 525 mmHg, PO2 = 108.8 mmHg, 5小时/天)的减压低氧处理。通过酶解法得到单个心肌细胞,利用全细胞膜片钳技术记录ICaL及INa/Ca,观察CIHH对大鼠心肌细胞ICaL和INa/Ca的影响。结果:1 ICaL1.1在正常细胞外液中,对照组和间歇性低氧组的ICaL峰值电流和I-V曲线无显著差异(P>0.05)。模拟缺血和再灌注时,CON28和CON42组心肌细胞的ICaL峰值电流明显减少(P<0.05),I-V曲线向上移位,而CIHH28和CIHH42组心肌细胞峰值ICaL电流和I-V曲线无明显变化(P>0.05)。1.2各组心肌细胞ICaL的稳态激活、失活后复活曲线在正常细胞外液、模拟缺血和再灌注条件下均无明显变化(P>0.05)。在正常细胞外液中,各组心肌细胞ICaL的稳态失活曲线无明显变化(P>0.05)。模拟缺血和再灌注时,CON组心肌细胞ICaL的稳态失活曲线向左移位(P<0.05),而CIHH组心肌细胞ICaL的稳态失活曲线无显著变化(P>0.05)。2 INa/Ca2.1正常细胞外液中,各组心肌细胞的INa/Ca无显著差异(P>0.05)。在模拟缺血条件下,CON28和CON42组心肌细胞INa/Ca的内向电流和外向电流部分均减少(P<0.05),内向电流的抑制比外向电流更明显。而CIHH28和CIHH42组心肌细胞INa/Ca无显著变化(P>0.05)。2.2模拟缺血条件下,CON28和CON42组心室肌细胞INa/Ca反转电位向负值方向移位(P<0.05),而CIHH28和CIHH42组心室肌细胞INa/Ca反转电位无显著变化(P>0.05)。小结: CIHH对基础状态的发育大鼠心室肌细胞ICaL和INa/Ca无影响,但可明显对抗缺血/再灌注对ICaL和INa/Ca的抑制作用。此作用可能是CIHH抗心肌缺血/再灌注损伤、对抗钙超载的离子机制之一。