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第一章:缺氧诱导因子-1a基因多态性与COPD易感性的关系 目的: 检测缺氧诱导因子-1a基因(hypoxia-inducible factor-1a HIF-1a)第12外显子上C1772T和G1790A单核苷酸多态性等位基因频率及其组合基因型分布特征,以探讨缺氧诱导因子-1a基因多态性与慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)易感性的关系。 实验方法: 1.研究分两组:慢性阻塞性肺疾病病例组120例,健康对照组112例。病例组人群均来自广东省人民医院就诊的慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者;健康对照组均为与病例组性别、年龄相匹配的来自于广东省人民医院体检中心正常体检的健康人群。收集时间为2010年5月至2011年6月。 2.抽取两组人群(清晨、空腹)外周静脉血2ml,采用全血基因组DNA提取试剂盒提取外周静脉血基因组DNA。 3.利用限制性片段长度多态性-聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术检测两组人群缺氧诱导因子-1a基因(HIF-1a)C1772T和G1790A的多态性分布。 4.统计学处理:采用SPSS13.0软件包进行统计分析,应用Hardy-Weinberg平衡法检验各基因频率的代表性;两组间基因型频率、等位基因分布及性别构成比采用χ2检验,两组的年龄、吸烟指数、肺功能比较(FEV1/FVC、FEV1/预计值％)采用非配对t检验。P<0.05具有统计学意义。 实验结果: 1.两组人群间的性别、年龄、吸烟指数等无统计学差异(P>0.05),COPD病例组的FEV1/预计值(%)、FEV1/FVC(%)明显低于健康对照组。 2.缺氧诱导因子-1a基因COPD病例组、健康对照组及总人数组各基因型分别符合Hardy-Weinberg平衡定律,缺氧诱导因子-1a基因位点在病例组和对照组中具有群体代表性。 3.病例组缺氧诱导因子-1a基因C1772T的CC、CT、TT3种基因型分布频率:87.5%、12.5%、0%,对照组:93.8%、6.2%、0%,两组基因型频率分布差异无统计学意义(P>0.05);病例组C、T等位基因分布频率:93.8%、6.2%,对照组:96.9%、3.1%,两组等位基因分布差异也无统计学意义(P>0.05)。 4.病例组缺氧诱导因子-1a基因G1790A的GG、GA、AA3种基因型分布频率:96.7%、3.3%、0%,对照组:90.2%、9.8%、0%,两组基因型频率分布差异具有统计学意义(P<0.05)。病例组G、A等位基因的分布频率为:98.4%、1.6%,对照组:95.1%、4.9%,两组等位基因分布差异也具有统计学意义(P<0.05)。 第二章:缺氧诱导因子-1a在COPD患者肺组织中的表达及意义 目的: 检测缺氧诱导因子-1a(hypoxia-induciblefactor-1a HIF-1a)在慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)患者肺组织中的表达水平,探讨HIF-1a与慢性阻塞性肺疾病(COPD)发生、发展的相关性。 材料与方法: 1.实验对象及分组 研究分两组:慢性阻塞性肺疾病需行肺叶组织切除组(以下简称病例组,16例)及无慢性阻塞性肺疾病需行肺叶组织切除组(以下简称对照组,16例)。全部研究对象均选自广东省人民医院需行肺叶组织切除的肺组织标本。本研究经过广东省人民医院伦理委员会批准,并通过受试对象的知情同意。收集时间为2010年5月至2011年6月。 2.实验方法: 2.1、实验标本的获取与处理 实验所用的肺组织标本取自尽量远离组织病灶(距病灶8cm以上)、肉眼观察无明显浸润的外周肺叶组织。手术取下肺组织标本,立即置入液氮罐中速冻,然后将组织标本移存于深低温冰箱(-70℃)中长期贮存备用,避免组织的反复冻融。 2.2、观察指标: 1)通过实时荧光定量PCR(real time PCR,RT-PCR)方法检测COPD病例组及对照组肺叶组织中HIF-1amRNA水平差异的表达情况。 2)通过酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法检测COPD病例组及对照组肺叶组织中HIF-1a蛋白水平差异的表达情况。 3)通过Westernblot方法进一步检测COPD病例组及对照组肺叶组织中HIF-1a蛋白水平差异的表达情况。 3.统计学方法 采用SPSS13.0统计分析软件,根据数据资料的不同类型,进行相应的统计处理。服从正态分布的计量资料以均数±标准差(`x±s)表示,两组间比较用t检验,以P<0.05表示差异有统计学意义。 实验结果: 1.实时荧光定量PCR测得慢性阻塞性肺疾病病例组及对照组肺叶组织标本中均表达HIF-1amRNA。依据各个扩增产物的CT值,按照公式Delta-deltaCt法计算病例组及对照组肺叶组织标本中HIF-1amRNA的表达程度。结果病例组与对照组肺叶组织标本中HIF-1amRNA分别为:1.01±0.50、1.28±1.51;COPD病例组肺叶组织标本中HIF-1amRNA表达水平低于对照组,t检验差异无统计学意义(P>0.05)。 2.酶联免疫分析(ELISA)法检测可知,慢性阻塞性肺疾病病例组及对照组人群肺叶组织中均明显表达HIF-1a。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样本浓度。结果病例组与对照组肺叶组织中HIF-1a蛋白分别为:0.16±0.07、0.96±0.43;COPD病例组肺叶组织标本中HIF-1a蛋白表达水平明显低于对照组,t检验差异有统计学意义(P<0.05) 3.Western blot进一步分析HIF-1a蛋白水平的表达,结果慢性阻塞性肺疾病病例组及对照组肺叶组织标本中均表达HIF-1a蛋白。以HIF-1a和内参β-actin灰度比值表示HIF-1a蛋白的表达水平。结果病例组与对照组肺叶组织标本中HIF-1a蛋白分别为:0.53±0.15、0.71±0.22;COPD病例组肺叶组织标本中HIF-1a蛋白表达水平明显低于对照组,t检验差异有统计学意义(P<0.05);依据COPD疾病的严重程度将病例组人群分组,结果发现轻中度COPD和重度COPD患者肺叶组织标本中HIF-1a蛋白分别为:0.78±0.06、0.39±0.10;重度COPD患者肺叶组织标本中HIF-1a蛋白表达水平明显低于轻中度COPD患者,t检验差异有统计学意义(P<0.05)。 全文结论: 研究结果显示,HIF-1a基因G1790A单核苷酸多态性与我国南方汉族人群慢性阻塞性肺疾病(COPD)的易感性有关,HIF-1a在慢性阻塞性肺疾病的发生、进展中起着某种至关重要的作用,筛查该SNP、制定针对其表达的干预手段对COPD的防治可能具有一定的意义。