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前言晶状体后囊膜混浊（posterior capsule opacification,PCO）是白内障术后远期视力下降的主要原因。其发生机理主要与白内障术后赤道部晶状体上皮细胞（1ens epithelial cells,LECs）过度增殖并迁移至后囊膜分化为成纤维细胞有关。临床上通常采用YAG激光后囊膜切开术治疗这一并发症,但该方法会增加视网膜脱离、黄斑囊样水肿及眼内压升高的风险。白内障手术技术的提高、IOL设计和材料的改善、以及各种抗增殖药物的应用,虽然在一定程度上可降低PCO的发生率,但尚未能从根本上解决这一问题。因此,探索新的PCO防治途径具有重要意义。随着分子生物学技术的迅速发展,基因治疗技术逐渐被引入PCO防治研究中。目前PCO基因治疗的研究主要集中于自杀基因、细胞周期调控基因和细胞因子相关基因等。这些方法为.PCO的治疗提供了新思路,但仍存在一些缺陷。RNA干扰（RNA interference,RNAi）作为一种新型的基因沉默技术,在生物基础研究中得到广泛应用。本研究拟应用RNAi抑制Bcl-2基因表达,诱导LECs凋亡,从而实现清除增殖的LECs这一目标。为临床解决白内障术后PCO问题提供方法和依据。聚酞胺一胺型树枝状高聚物（PAMAM dendrimers）作为一种非病毒纳米载体,具备无免疫原性、无遗传毒性、转染效率高、可长期稳定表达等优良特性,在基因治疗领域具有良好的应用前景。本研究采用PAMAM G5介导基因转染,观察其与脂质体转染法间的差异。本研究构建了2条以bcl-2基因为靶标的短发夹状RNA（shRNA）,克隆入质粒PGCsi表达载体,分别用脂质体和PAMAM介导转染体外培养的HLECs,检测转染后BCL2基因表达的变化,观察细胞凋亡的情况。同时比较了PAMAM与脂质体在基因导入方面的差异。第一部分Bcl-2 shRNA表达载体的构建、扩增及鉴定目的构建2条Bcl-2 shRNA表达载体方法从GenBank中选取Bcl-2的基因序列（No.NM000633）作为分析序列,在Bcl-2 cDNA上寻找2条符合特征的靶序列（编码区分别为1210—1228,2133—2151）。设计可克隆入PGCsi表达载体的短发夹状RNA（shRNA）,5’端对应于BamHⅠ的酶切位点,在3’端带有T6序列,对应于HindⅢ的酶切位点,命名为P1、P2;同时采用通用阴性对照,命名为P0。寡核苷酸链经退火、连接入线性化载体PGCsi,转化感受态细菌DH5α,再作扩增和测序鉴定。结果重组质粒经自动基因测序仪测序,结果与设计序列完全相同,所含目的基因序列准确无误,质粒构建成功。质粒扩增后的浓度与纯度均满足基因转染的要求。结论成功构建了2条Bcl-2 shRNA表达载体第二部分脂质体介导BCL-2 shRNA转染诱导晶状体上皮细胞凋亡目的应用RNA干扰技术抑制晶状体上皮细胞bcl-2基因表达,观察诱导晶状体上皮细胞（HLECs）凋亡情况方法脂质体LipofectamineTM2000介导BCL-2 shRNA（P1、P2、P0）转染人永生性HLECs系SRA01/04,48h后流式细胞仪检测转染效率,免疫印迹法检测bcl-2蛋白的表达,荧光定量PCR检测bcl-2 mRNA表达,并分别用Annexin V-FITC/PI双染法、Hoechst染色法、免疫印迹法检测caspase-3的表达等方法来检测HLECs的细胞凋亡情况。结果转染48h后,流式细胞仪检测发现,P1、P2、P0组的转染率分别为44.1±1.7%、47.2±1.6%、43.8±2.3%,各组间无统计学差异（p＞0.05）。免疫印迹法和荧光定量PCR表明,P1和P2均可抑制bcl-2蛋白和mRNA的表达,与空白组比较差异具有统计学差异（p＜0.05）。Annexin V-FITC/PI双染法检测得P1和P2组凋亡率分别为42.3±0.7%和45.4±0.9%,与空白对照组比较差异有统计学意义（p＜0.05）。P0组可见极少量细胞凋亡,与空白对照组比较差异无统计学差异（p＞0.05）。Hoechst染色显示P1和P2组HLECs细胞核变小,呈亮蓝色,可见核碎裂,而对照组的核呈均匀的蓝色。免疫印迹法测得P1、P2组细胞活化型caspase-3蛋白的表达较P0组、空白对照组增强。结论脂质体可有效介导BCL-2 shRNA转染HLECs。P1、P2可抑制HLECs的BCL-2基因表达。BCL-2基因表达抑制后,HLECs的细胞凋亡增加。第三部分PAMAM介导Bcl-2 shRNA转染诱导晶状体上皮细胞凋亡目的通过PAMAM G5介导Bcl-2 shRNA表达载体质粒,转染HLECs,观察BCL-2基因表达的情况及对HLECs细胞凋亡的影响。方法制备PAMAM G5/Bcl-2 shRNA复合物（质量比6:1）,转染人永生性HLECs系SRA01/04,同时设脂质体对照组、裸质粒对照组、空白对照组。48h后流式细胞仪检测转染效率,免疫印迹法检测bcl-2蛋白的表达,荧光定量PCR检测bcl-2 mRNA表达,并分别用Annexin V-FITC/PI双染法、Hoechst染色法、免疫印迹法检测caspase-3的表达等方法来检测HLECs的细胞凋亡情况。结果转染48h后,流式细胞仪检测转染率,PAMAM G5组为48.5±1.5%,脂质体组为41.1±1.8%,裸质粒组和空白对照组未见明显转染。PAMAM G5组转染率高于脂质体组,差异具有统计学差异（p＜0.05）。免疫印迹法和荧光定量PCR表明,PAMAM G5组可抑制bcl-2蛋白和mRNA的表达,与空白组比较差异具有统计学差异（p＜0.05）。Annexin V-FITC/PI双染法检测得PAMAM G5组凋亡率为44.7±1.2%,与空白对照组比较差异有统计学意义（p＜0.05）。Hoechst染色显示P1和P2组HLECs细胞核变小,呈亮蓝色,可见核碎裂,而对照组的核呈均匀的蓝色。免疫印迹法测得PAMAM G5组细胞活化型caspase-3蛋白的表达较空白对照组增强。结论PAMAM G5可有效介导Bcl-2 shRNA转染HLECs,转染率高于脂质体。转染后,BCL-2基因表达受抑制,HLECs的细胞凋亡增加。