【摘 要】
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miRNA是一类广泛存在于生物体内长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,主要通过参与基因的转录后调控实现调节靶基因的表达。miRNA可调控与细胞生长、发育和分化有关的各种关键基因,并与各种人类疾病有关。许多研究表明miRNA与肿瘤的发生,发展和侵袭密切相关,miRNA可以调节细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移和肿瘤的血管发生,因此,miRNA的体内失调是包括肿瘤在内的许多疾病发病机理的关键。miR
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miRNA是一类广泛存在于生物体内长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,主要通过参与基因的转录后调控实现调节靶基因的表达。miRNA可调控与细胞生长、发育和分化有关的各种关键基因,并与各种人类疾病有关。许多研究表明miRNA与肿瘤的发生,发展和侵袭密切相关,miRNA可以调节细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移和肿瘤的血管发生,因此,miRNA的体内失调是包括肿瘤在内的许多疾病发病机理的关键。miR-16-5p在多种物种间高度保守,是细胞内多条关键信号通路的重要调控元件,和细胞周期、细胞凋亡和细胞增殖等生理过程密切相关。据报道,miR-16-5p在许多常见类型的人类癌症中经常缺失或被下调,关乎癌症的发生和发展。但关于其对肝癌的调控机制所见甚少,且缺少详细的分子调控机制。为研究其在肝癌中的调控作用,本课题从体外水平上研究了miR-16-5p对肝癌细胞HepG2的调控作用及分子机制,该研究结果可能为肝癌新型疗法的开发提供重要的理论基础。首先,为了探究miR-16-5p在肝癌中可能存在的调控作用,我们用q RT-PCR方法检测了四种不同细胞中miR-16-5p的表达水平,发现miR-16-5p在三种肝癌细胞中的表达水平均显著低于人正常肝细胞7702,因此推测miR-16-5p可能在肝癌中发挥潜在作用,鉴于其在HepG2细胞中的低表达程度更为显著,因此选择人肝癌细胞HepG2细胞作为实验材料。随后我们通过对细胞转染miR-16-5p模拟物或抑制物的方法,人工干预细胞内miR-16-5p的表达。进而采用CCK-8、Ed U、流式细胞术、划痕实验和Western Blot等试验方法检测miR-16-5p水平变化对HepG2细胞活力、细胞增殖、细胞周期、细胞迁移能力的影响。结果表明过表达的miR-16-5p显著降低了HepG2细胞的活力,抑制了细胞增殖和周期相关基因的表达,进而抑制了细胞增殖,且抑制了HepG2细胞的迁移。研究表明Smad3作为TGF-β信号传导途径中的主要细胞内受体,在各种癌症中,如肺癌、前列腺癌和胰腺癌中促进侵袭和转移细胞的增殖和迁移,而且Smad3已在多种癌组织中被鉴定为miR-16-5p的下游靶标之一。为进一步验证miR-16-5p/Smad3通路是否对HepG2细胞发挥调控作用,我们检测了miR-16-5p干预后对Smad3表达的影响,Western Blot结果显示过表达的miR-16-5p显著抑制了Smad3蛋白的表达,而抑制miR-16-5p的水平则表现出相反的现象,此结果表明了Smad3作为HepG2细胞中miR-16-5p的直接下游靶标,miR-16-5p可以在转录后水平上直接抑制Smad3蛋白的表达,进而调控HepG2细胞的增殖,这些结果均为肝癌的靶向治疗提供了理论基础。
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