前言:胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤,占中枢神经系统原发肿瘤的50%以上,具有高死亡率,高复发率的特点。尽管针对胶质瘤的诊疗理念与诊疗手段一直在进步,胶质母细胞瘤患者的中位生存期仅为15个月,寻找新的胶质瘤治疗方法十分重要。胶质瘤按照特征基因表达可以分成神经元型（NE）、经典型（CL）,前神经元型（PN）以及间质型（MES）四种。间质型胶质瘤具有侵袭性高,治疗抵抗,易复发以及预后差的特点。研究表明,胶质瘤具有演进性,可以从一种分型转化成另一种分型。间质型转化常与治疗抵抗与恶性进展有关。因此,探究间质型转化的驱动机制与驱动基因对于胶质瘤的治疗有着重要的意义。前期研究认为,该过程可能是由微环境,炎症因素,表观遗传因素共同参与的,但具体机制仍有待进一步详细探究。目前,癌症研究已经进入泛癌时代,包括TCGA和ICGC等知名癌症研究计划已经从泛癌的角度开始对癌症进行研究。本研究将以泛癌为出发点对胶质瘤的间质化进行研究。研究方法:（1）数据库信息与组织标本:相关生物信息学分析所用数据由TCGA、CGGA、GEO、GDSC以及论文引文数据平台获取,我们选取TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据平台作为主体分析数据库,选取其他数据平台作为外部验证数据库。分子生物学实验验证所需组织标本在取得患者及家属知情同意的情况下由本单位手术获得,相关实验计划通过本单位伦理委员会审核及批准。（2）生物信息学分析方法:一致性聚类被用来对肿瘤间质转化状态进行分类;主成分分析（PCA）被用来分析聚类效果;通过limma R包进行差异基因筛选;通过Metascape数据库和Cytoscape软件对差异基因进行生物学过程与分子通路解析;基因集富集分析（GSEA）用于对富集出的差异功能及通路进行进一步验证;ssGSEA被用来进行单样本通路活性评分;Estimate R包被用来进行肿瘤样本的纯度及免疫评分、基质评分计算;Cibersort R包计算样本中各个非肿瘤细胞组分的相对含量;机器学习算法被用来对外部数据库进行肿瘤间质转化状态再分类。（3）细胞系研究模型:人源胶质瘤细胞系LN229、U87、U251、巨噬细胞系THP-1、人源乳腺癌细胞系MDA-231、MDA-468购买自中国科学院上海细胞库;人源胶质瘤细胞系T98、鼠源胶质瘤细胞系GL261购买自ATCC;人源胶质瘤原代细胞系由论文作者所在团队自行提取;鼠源胶质瘤自发细胞系通过sleeping beauty转座子系统构建。（4）分子生物学实验:应用qPCR、WB、免疫组化及免疫荧光验证分子表达情况;应用Transwell实验检测胶质瘤细胞/巨噬细胞细胞的侵袭及迁移能力;MTS用于测定细胞增殖活力;颅内原位成瘤模型用于表型或机制的体内验证;利用DCFH-DA试剂盒检测活性氧的含量。（5）流式以及质谱流式实验:流式相关实验用来进行免疫微环境分析。流式实验由作者完成,流式质谱实验委托北京诺禾致源有限公司完成。（6）统计学分析:应用卡方分析、方差分析以及独立样本t检验考察分组的变量之间是否存在差异。应用Cox回归分析确定影响患者生存预后相关因素或靶点。通过Kaplan-Meier曲线描绘患者生存状态,并进行Log-rank检验比较不同分组患者之间的生存状态差异。相关性分析采用Pearson检验完成。使用GraphPad Prism 7和R3.6.1等软件完成上述相关分析。FDR矫正被用来进行p值的检验,来排除假阳性结果。将双尾p值或FDR值小于0.05界定为差异存在统计学意义的标准。结果:第一部分:利用蛋白互作和基因共表达分析,构建了包含35个基因的基因集。利用构建的包含35个基因的基因集,我们把TCGA数据集中24种上皮癌的9,415名患者利用表达谱进行聚类。根据间质转化状态（MTLow,MTMid,MTHigh-YAP和MTHigh-AKT）建立了四个分类。超几何富集分析发现,间质亚型胶质瘤在MTHigh-YAP和MTHigh-AKT均明显富集。对两个MTHigh类之间的间质转化状态的不同机制的评估表明,MTHigh-YAP是由几种经典的体细胞改变（如FAT1）驱动的。FAT1抑制了Hippo途径并因此促进了 YAP核易位,FAT1突变与CDKN2A缺失和MYC突变共同导致了 MTHigh-YAP型细胞周期发生了紊乱。MTHigh-AKT型的间质转化状态是通过与浸润的巨噬细胞以AKT依赖性方式相互作用来维持的。此外,肿瘤细胞与巨噬细胞之间的相互作用也导致MTHigh-AKT型的免疫抑制表型。这种互作可以在不依赖CD8+T细胞的情况下,上调PD-L1的表达,因此免疫检查点阻断治疗可能无效。AKT信号通路是MTHigh-AKT型免疫抑制的关键信号枢纽。利用体内实验证实抑制AKT途径是提高胶质瘤免疫检查点阻断治疗的有效方法。最后我们构建了Tumor MT网站（http://tumormt.neuroscience.org.cn）,通过上传表达谱即可获得独立样本的间质型分类,并利用CGGA数据库的胶质母细胞瘤数据进行了验证,从而提高研究的应用价值。第二部分:通过体外和体内功能学实验我们发现,CLCF1与胶质瘤的恶性行为有关,并且可能参与巨噬细胞的趋化。通过基因富集分析,我们发现MTHigh-AKT型中活性氧代谢显著升高。通过5维活性氧代谢评估模型,我们发现胶质瘤组织中活性氧含量显著高于其他肿瘤组织。利于体外测定,我们发现巨噬细胞中活性氧含量要高于肿瘤细胞,从而提出巨噬细胞/活性氧/胶质瘤-AKT/CLCF1的作用机制。利用核质分离实验,我们证实,CLCF1可以影响NF-KB的磷酸化,从而影响NF-KB的入核情况。最后我们证实,活性氧调控对联合NF-KB阻断在胶质瘤的治疗中可能存在协同作用。结论:第一部分:通过泛癌分析我们证实上皮肿瘤包括胶质瘤拥有不同的间质化转化状态,并且其驱动机制不同。应充分考虑肿瘤的间质化状态以进行精确的分类和治疗。第二部分:CLCF1是介导肿瘤与巨噬细胞互作的关键细胞因子,其可以促进胶质瘤的恶性行为以及巨噬细胞的趋化。开发针对CLCF1的靶向治疗对于胶质瘤的治疗有一定的意义。