小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus,WYMV）属于马铃薯Y病毒科大麦黄花叶病毒属。基因组含两条单链正义RNA,WYMV基因组的5‘端没有帽子结构,有共价结合的Vpg蛋白,3‘端有poly（A）尾;RNA1全长约7.6 kb,RNA2全长约3.6 kb,分别编码一个约270 KDa和100 KDa的多聚蛋白,经蛋白酶切割共产生10个成熟的功能蛋白,另外可能以转录水平的移码策略产生P3N-PIPO蛋白。本研究主要是解析WYMV不依赖帽子翻译调控机理,分析WYMV RNA1和RNA2的核心调控元件以及WYMV不同分离物间不依赖帽子翻译调控元件的差异化调控。首先,分别从泰安和临沂发病小麦新克隆了WYMV泰安分离物（TADWK）和临沂分离物（LYJN）的全基因组序列。WYMV不同分离物RNA的5‘UTR序列一致性较低,是突变热点区域,暗示5‘UTR在WYMV的基因表达调控中可能发挥重要作用。利用麦胚提取物的体外翻译系统和萤火虫荧光酶素（Fluc）载体,结合WYMV潢川分离物（HC）分析了实验室已有的三个分离物（TADWK、LYJN、HC）的RNA1和RNA2的5‘UTR对不依赖帽子翻译的调控作用。结果表明,3个WYMV分离物的RNA1和RNA2的5‘UTR均具有不依赖帽子翻译增强子活性。3个分离物的RNA1的5‘UTR的翻译调控效率基本一致,而3个分离物的RNA2的5‘UTR的翻译调控效率相差可达约7倍。选取WYMV潢川分离物（HC）RNA1为研究对象分析WYMV RNA1的不依赖帽子翻译调控机制。RNA1 5‘UTR具有IRES活性,且3‘UTR可协同提高5‘UTR的IRES活性3.15倍;梯度缺失实验定位了RNA1的IRES活性核心区为20-130 nt。利用In-line probing技术分析RNA1 5‘UTR的空间结构,IRES核心区主要包括2个茎环（H1和H2）和1个连接区（LR1）;比较3‘UTR加入后的RNA结构变化,初步定位了RNA1 5‘UTR和3‘UTR的潜在远距离RNA-RNA互作。利用EMSA和突变体的体外翻译分析定位了5‘UTR和3‘UTR远距离RNA-RNA互作区域是⁸⁰CU和⁷⁵⁷⁴AG,并且该保守性的互作对于IRES的翻译效率有明显提升作用。茎环H1的茎部稳定性以及顶环3‘端区域的碱基特异性正调控IRES活性,茎环H2的茎长度和顶环5‘端区域的碱基特异性与IRES活性正相关。反式竞争实验发现,WYMV RNA1 5‘UTR的IRES元件属于eIF4E依赖型,且eIF4E结合靶标主要位于茎环H2的顶环区域,尤其是¹¹⁴CUUUCC。此外,In-line probing实验表明茎环H1和H2中的胞嘧啶(C⁵⁵、C⁶⁶、C¹⁰⁵和C¹⁰⁸)以及LR1中的鸟嘌呤(G⁷³、G⁷⁹和G⁸⁵)处于碱基被封闭状态,通过一系列突变体的体外翻译实验,发现这4个C和3个G形成不连续的C-G碱基配对,且处于动态平衡状态。茎环H1中的胞嘧啶(C⁵⁵和C⁶⁶)和LR1中的鸟嘌呤(G⁷³、G⁷⁹和G⁸⁵)的碱基配对正向调控IRES活性,茎环H2中的胞嘧啶(C¹⁰⁵和C¹⁰⁸)和LR1中的鸟嘌呤(G⁷³、G⁷⁹和G⁸⁵)的碱基配对负调控IRES活性,WYMV RNA1 5‘UTR中由不连续的C-G碱基配对(C⁵⁵、C⁶⁶、C¹⁰⁵、C¹⁰⁸与G⁷³、G⁷⁹、G⁸⁵)形成的稳态结构精细调控蛋白翻译水平。这是IRES元件中首次发现动态平衡状态,并且暗示WYMV RNA1的翻译进化方向是翻译水平的适量,而不是翻译最大化。由于WYMV不同分离物RNA2 5‘UTR的不依赖帽子翻译调控活性存在显著差异,利用WYMV潢川分离物（WYMV-HC）和临沂分离物（WYMV-LYJN）的RNA2进行比较研究。WYMV RNA2的5‘UTR也具有IRES活性,且3‘UTR可协同提高其IRES活性1.5倍。梯度缺失实验表明,WYMV-HC RNA2和WYMV-LYNJ RNA2的5‘UTR的IRES核心区分别位于20-150 nt和30-150 nt。In-line probing技术分析了两种WYMV分离物RNA2 5‘UTR的结构,表明WYMV-HC与WYMV-LYJN的RNA2 5‘UTR结构存在两个明显的差异区,包括第一个茎环（H1）结构的基部茎的结构稳定性和第二个茎环（H2）结构的顶环的碱基特异性;一系列的突变实验表明,这两个区域的差异是造成两个WYMV分离物RNA2的IRES活性差异的主要原因。还发现两个WYMV分离物RNA2 5‘UTR茎环H1都存在一个碱基相对保守的顶环,且这个保守的顶环在翻译过程中至关重要。反式竞争实验表明WYMV RNA2的IRES元件属于eIF4E依赖型,其中在WYMV-HC中eIF4E的结合靶标位于茎环H1的顶环,而在WYMV-LYJN中eIF4E的结合靶标位于茎环H1和茎环H2的顶环。以上结果暗示,造成WYMV-HC和WYMV-LYJN翻译的显著差异的根本原因在于其eIF4E结合位点的数目不同,导致同等条件下结合eIF4E的效率不同。通过本研究,首次完成马铃薯Y病毒科中唯一双分体病毒属（大麦黄花叶病毒属）的IRES调控机制研究,发现了WYMV RNA1 IRES的动态平衡调控模型和RNA2 IRES的差异化调控模型,丰富了植物RNA病毒的IRES研究纵深,同时为WYMV病毒病的防治提供理论依据和防治靶标。