目的:参附汤（SFD）是中医临床益气回阳固脱的代表方,能够治疗多种心脏疾病,对心肌缺血再灌注损伤（MIRI）也有明确的保护作用,但其分子机制尚不明确。本研究运用细胞生物学,分子生物学等技术方法检测H9C2心肌细胞生存率、细胞内钙浓度变化及钠钙交换体（NCX1）、肌浆网钙-ATP酶（SERCA2a）、钙离子通道蛋白（Cav1.2）等钙稳态调控蛋白表达等指标,探讨SFD中三种重要有效成分人参皂苷Re,Rg1及乌头原碱（Aconine）及配伍对H9C2心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用。此外,结合三种单体和配伍对钙超载下游信号的影响,初步阐明参附汤有效成分及配伍针对钙超载的细胞保护信号通路;以期从分子层面探究参附汤调控缺血再灌注后胞内钙离子超载的作用机理。方法:（1）建立H9C2心肌细胞缺氧复氧（HR）损伤模型:采用H9C2心肌细胞系,以惰性气体联合无糖无血清培养基对H9C2心肌细胞进行缺氧处理,随后将细胞转移至正常培养箱、新鲜培养基中进行复氧。以体外细胞HR模型模拟心肌缺血再灌注过程。采用CCK-8检测心肌细胞生存率,以细胞生存率在50%左右时的实验条件为最佳实验条件。（2）检测三种有效成分对H9C2心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用:分别采用不同浓度的三种有效成分对H9C2心肌细胞进行24h预处理并持续至HR过程结束。随后采用CCK-8检测正常组及模型组细胞生存率。（3）三种有效成分对H9C2心肌细胞缺氧复氧后胞内钙离子浓度的调节作用:分别采取不同浓度的三种有效成分进行24h预处理并持续至HR过程结束。随后采用Fura2-AM探针检测正常组,模型组,给药组的胞内钙离子浓度。（4）筛选三种有效成分各自的最佳浓度及三者最优配伍:综合上述细胞生存率及检测钙离子浓度的实验结果,比较得出每种有效成分的最佳浓度。并以最佳浓度为ED100,运用统计软件计算三种有效成分的ED10,ED50并依据三因素三水平正交设计进行配伍。随后运用CCK-8检测细胞生存率,以提升缺氧复氧后细胞生存率幅度最高者为最优配伍。（5）三种有效成分和最优配伍对NCX1,SERCA2a,Cav1.2三种钙稳态相关蛋白表达的影响和钙超载细胞保护通路的研究:最佳浓度的三种有效成分和最优配伍对细胞进行预处理后,提取各组细胞蛋白。运用Western-Blot分析各组蛋白中NCX1,SERCA2a,Cav1.2,P25表达的变化,从而深入探讨有效成分单独使用和配伍使用对钙稳态调控蛋白表达的影响及针对钙超载后细胞保护作用的分子通路。结果:（1）建立H9C2心肌细胞HR损伤模型:H9C2细胞经过不同时间的缺氧复氧处理后,细胞生存率呈现明显差异。结果发现以1 00%N2联合无糖无血清培养基培养H9C2心肌细胞4h后,在正常条件下复氧培养3h,细胞生存率在52%左右,较正常组生存率下降了约48%（P<0.01）,且重复后结果较为稳定。故在后续实验中,以100%N2联合无糖无血清培养基缺氧处理4h,复氧处理3h作为本次实验的基本实验条件。（2）三种有效成分对H9C2心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用:人参皂苷Re仅在200μM时,对细胞生存率显示明显提升作用,可将模型组生存率提高约12%（P<0.05）;Rg1在200μM、100μM、50μM时均可发挥明显的提升细胞生存率的作用,可分别将生存率提高约 25%（P<0.01）,22%（P<0.01）,17%（P<0.05）;Aconine浓度在100μM和200μM时可明显提高缺氧复氧后细胞生存率,可分别提高约 28%（P<0.01）和 15%（P<0.05）。（3）三种有效成分对H9C2心肌细胞缺氧复氧后胞内钙离子浓度的调节作用:经过三种有效成分预处理后,发现三种有效成分的每个浓度均可发挥降低胞内钙离子浓度的作用。比较各浓度有效成分降低胞内钙离子浓度作用,发现200μM Re预处理可最大程度降低模型组Ratio值,Ratio值可由1.6687±0.03705降低至1.5204±0.10529,可降低约7.8%（P<0.001）;200μM Rg1预处理可最大程度降低模型组 Ratio 值,Ratio值可由1.6487±0.03705 降低至1.3477±0.03667,可降低约18.3%（P<0.001）;100μM Aconine预处理可最大程度降低模型组Ratio值,Ratio值可由 1.6419±0.01496 降低至 1.3363±0.09447,可降低约18.6%（P<0.001）。（4）确定三种有效成分最佳浓度及最优配伍:通过综合不同浓度有效成分在细胞生存实验和检测胞内钙离子浓度的实验结果,分析Re的最佳浓度为200VM,Rg1为200μM,Aconine为100μM。根据统计学软件计算后,分别以每种有效成分的最佳浓度为ED100,计算每种有效成分的ED50,ED10。得出Re的三个水平分别为80μM,120μM、200μM;Rg1 的三个水平分别为 25μM、50μM、200μM;Aconine的三个水平分别为25μM、50μM、100μM。经过三因素三水平正交实验后,运用CCK-8检测各组生存率。结果显示在Rg1 200μM,Aconine 100μM,Re为25μM时对细胞生存率的提升作用最为显著,可将模型组细胞生存率提升约33%（P<0.01）。（5）三种有效成分和最优配伍对NCX1,SERCA2a,Cav1.2三种钙稳态相关蛋白表达的影响和钙超载细胞保护通路的研究:Western-Blot结果显示三种有效成分分别对不同的钙稳态相关蛋白的表达有不同影响。200μM Re可明显提高SERCA2a的表达,蛋白相对密度由模型组0.4522 ± 0.02205提升至1.85±0.07882（P<0.05）;200μM Rg1可明显提高SERCA2a蛋白的表达,蛋白相对密度由模型组0.4522±0.02205提升至1.5623±0.25894（P<0.05）,同时降低蛋白NCX1的表达,蛋白相对密度由模型组 1.475±0.23707 降低至 0.6048±0.14241（P<0.01）;100μM Aconine可明显降低Cav1.2的表达,蛋白相对密度由模型组1.45±0.34828降低至0.51±0.06083（P<0.01）。而三者配伍对三种蛋白的表达均有优势方向的影响,即降低Cav1.2的表达,蛋白相对密度由模型组1.2082±0.26303降至0.6476±0.7413（P<0.05）;降低NCX1的表达,蛋白相对密度由模型组1.5590±0.06863降至0.8582±0.12889（P<0.01）;提高蛋白SERCA2a蛋白的表达,蛋白相对密度由模型组0.559±0.06863提高至0.8582±0.12889（P<0.01）;在研究参附汤有效成分调控钙稳态蛋白发挥主要作用的同时,我们发现三种有效成分和最优配伍均可降低P25蛋白的表达。由于钙离子超载后可激活calpain的水解活性,P25作为calpain的水解产物,P25蛋白表达的降低则代表calpain水解活性的降低。这就表明三种有效成分和最优配伍可抑制calpain活性,从而减少calpain对细胞结构的水解进而发挥细胞保护作用。结论:参附汤三种有效成分Re,Rg1和Aconine不同浓度预处理均可提高H9C2心肌细胞缺氧复氧模型生存率,配伍应用后,对细胞生存率的提升作用较三种有效成分单独应用更显著;参附汤有效成分Re、Rg1和Aconine不同浓度预处理均可降低H9C2缺氧复氧细胞胞内钙离子的浓度,配伍应用后降低钙离子浓度的作用较单独应用更为显著。参附汤有效成分Re、Rg1可增加H9C2细胞SERCA2a蛋白的表达;Rg1还可以降低NCX1蛋白的表达;Aconine可减少H9C2细胞Cav1.2蛋白的表达;三种成分配伍可增加蛋白SERCA2a的表达,并降低蛋白NCX1和Cav1.2的表达。同时,三种有效成分单独和配伍应用均可使calpain的水解产物P25的表达减少,增强对H9C2心肌细胞缺氧复氧后损伤的保护作用;上述结果表明三种有效成分和配伍应用可以通过调控钙稳态相关蛋白减轻钙超载,并直接抑制calpain活性,减轻钙超载诱发的细胞损伤,发挥对细胞缺氧复氧损伤的保护作用。本研究从调控心肌细胞钙离子稳态的角度初步阐明了 SFD有效成分及配伍对心肌缺血再灌注损伤保护作用的关键机制,为临床应用参附汤治疗心肌缺血再灌注损伤提供了微观证据支持,并对参附汤的组方优化提供了参考。