最新的统计数字表明，肺癌的发病率和死亡率居各种恶性肿瘤之首，其中男性发病率为十万分之四十九点六，女性发病率为十万分之三十四。属于老年疾病的肺癌目前正在悄悄地“年轻化”，最年轻的肺癌患者仅有二十几岁。因此对肺癌的预防和早期诊断越发显得重要，但由于缺乏肺癌组织特异和时相特异的分子标志物，使得肺癌的早期诊断一直存在较大的困难，日益发展并完善的大规模蛋白质组研究技术，有望于用来发掘肺癌早期诊断的蛋白标志物。 蛋白质组是指细胞、组织或基因组所表达的全部蛋白质。在癌症蛋白质组学研究中，可以通过差异蛋白质组(功能蛋白质组)研究去发掘可能的药物标靶，以及适用于肿瘤分类、早期诊断、阻断和治疗的肿瘤标志物。 为发掘与肺癌相关的蛋白标志物，本课题建立了肺癌组织细胞无血清培养模型，希望通过对同一病人正常组织和癌变组织来源的细胞在无血清培养过程中分泌蛋白质组的分析，找到差异表达的蛋白质，作为潜在的与肺癌相关的蛋白标志物，然后回到临床实验，检验它是否可以作为分子标志物，达到肺癌早期诊断的目的。本课题通过对无血清培养基样品的预处理、一维SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离条件、胶内蛋白质酶解方法及鉴定等条件的优化，建立了无血清培养细胞分泌蛋白质组研究的技术方法，并在此基础上开展了差异蛋白质组研究，研究结果如下： 1 建立了两种适用于无血清培养分泌蛋白质分离与鉴定的技术方法：一种是SDS-PAGE分离技术与生物质谱肽质量指纹谱(PMF)技术联用，通过SDS-PAGE分离找到差异蛋白质，然后采用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和数据库检索进行差异蛋白质鉴定；另一种方法是将SDS-PAGE分离与液相色谱-电喷雾串联质谱测序技术联用，对SDS-PAGE分离的蛋白质条带按一定的宽度切割并进行胶内蛋白酶切和肽段提取，用毛细管反相色谱-串联质谱(nanoLC-ESI-MS-MS)对混合蛋白质进行分离鉴定，对鉴定的蛋白质进行比较分析，找到差异表达蛋白质。 2 对存在于无血清培养基内的分泌蛋白质采用透析方法除盐，考察了透析前后以及不同透析方法对分离效果的影响，实验结果表明，透析后样品的SDS-PAGE摘要分离效果明显提高，利用透析袋所获得的透析效果明显好于透析管。 3对蛋白质的胶上酶切方法进行了考察，通过对SDS一PAGE分离胶上蛋白质进行还原、烷基化等处理，改变酶切条件，得到一种适用于sDS一PAGE分离蛋白质的酶切方法。 4应用SDS一PAGE与MALDI一TOF一MS联用的方法，得到了一个在肺癌中高表达的蛋白质MMP一1，同时，临床免疫组化实验证明MMP一1定位于细胞浆，在肺癌组织高表达。 5应用SDS一PAGE与nan0LC一ESI一MS一MS联用方法分析成对临床病人的样品，从肿瘤细胞无血清培养基中鉴定出127个分泌蛋白质，正常细胞培养基中鉴定出113个蛋白质;肿瘤培养基内新发现的分泌蛋白质为110个，正常细胞培养基内新发现的分泌蛋白质为105个，仅在肿瘤细胞无血清培养基中发现的蛋白质为42个，仅从正常支气管上皮细胞无血清培养基发现的蛋白质为35个。 6对鉴定的分泌蛋白质做了临床免疫组化与 Westem一blotting分析。文献调研表明，其中大部分分泌蛋白与肿瘤的发生、发展密切相关，如:nm23一Hl在人肺癌中呈高表达，和肿瘤发生、发展相关;多篇文献报道，14一3一3和肺癌发生也有相关性，有可能作为潜在的诊断标志物之一。 7初步建立了肺癌组织细胞分泌蛋白质数据库，包含肿瘤细胞表达蛋白质177个，正常上皮细胞表达蛋白质150个(新发现的分泌蛋白质在肿瘤中为161，在正常中为137)。