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本实验室前期研究发现,uPA与锚定于自身细胞膜外的uPAR结合,进而促进细胞的增殖。为了深入了解uPA与uPAR调节体外培养牛卵丘颗粒细胞增殖的具体机制,本研究综合细胞培养、细胞增殖、Western bot、ELISA等多种技术,探讨了uPA、uPAR、cAMP和磷酸化ERK与AKT表达在牛卵丘颗粒细胞增殖过程中可能的互作机制。研究结果显示,(1)0.5ng/mL uPA分别作用不同时间2、5、10、20、30min后,5 min处理组显示最高的ERK与AKT磷酸化水平,均极显著高于对照组(P<0.01);联合添加0.5 ng/mL uPA与1μg/mL Amiloride处理5 min后,与uPA组相比,联合添加组(uPA+Amiloride)中磷酸化ERK与AKT表达量极显著降低(P<0.01),说明Amiloride能够明显抑制uPA对牛卵丘颗粒细胞中磷酸化ERK与AKT表达的促进作用。(2)联合添加0.5 ng/mL uPA与10μL/mLuPAR抗体继续培养5 min后,与uPA组相比,联合添加组(uPA+uPAR抗体)的磷酸化ERK与AKT极显著降低(P<0.01),说明uPA与其受体uPAR结合后,能够激活ERK与AKT信号。(3)联合添加uPA与Amiloride或者uPA与uPAR抗体分别培养5 min后,与对照组比较,添加uPA组能显著上调cAMP水平(P<0.01);与uPA组相比,联合添加组(uPA+Amiloride或uPA+uPAR抗体)极显著下调了cAMP水平(P<0.01),说明Amiloride能够抵消uPA对卵丘颗粒细胞内cAMP水平的提升作用,而此过程与uPAR相关。(4)联合添加0.5μM Rp-cAMP与uPA培养5 min后,与uPA组相比,联合添加组(uPA+Rp-cAMP)的磷酸化ERK与AKT表达量极显著降低(P<0.01),说明uPA通过上调cAMP水平,刺激PKA信号通路,进而激活下游ERK与AKT磷酸化过程。(5)联合添加Rp-cAMP与uPA培养48 h后,与uPA组相比,联合添加组(uPA+Rp-cAMP)中卵丘颗粒细胞数量极显著降低(P<0.01),说明Rp-cAMP能够抵消uPA对卵丘颗粒细胞增殖的诱导作用。综上所述,本研究揭示了uPA与uPAR调节牛卵丘颗粒细胞增殖的信号机制:uPA结合卵丘颗粒细胞膜上受体uPAR,上调细胞内cAMP水平,激活PKA通路,使下游ERK与AKT被磷酸化,最终促进体外培养的牛卵丘颗粒细胞增殖。本研究结果对于深入理解牛卵泡发育调控机制,具有重要意义。