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研究背景:转移是造成大多数恶性肿瘤患者死亡的主要原因。迁移和侵袭是肿瘤细胞转移的先决条件,趋化因子受体及其配体之间的相互作用在肿瘤细胞迁移和侵袭过程中发挥十分重要的作用,靶器官特异性表达的趋化因子与肿瘤细胞表达的相应受体参与转移器官的选择。关于趋化因子受体CXCR4(CXC chemokine recepter-4)及其配体SDF-1a(stromal cell-derived factor-1a)在肿瘤转移中的作用已在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌和肝癌等多种肿瘤中被报道。外泌体是最近发现的纳米级(直径30-150 nm)双层脂质膜性小囊泡,内含脂质、核酸(DNA、m RNA、非编码RNA)和蛋白质等成分。外泌体可被受体细胞摄取,通过转移其内容物而影响受体细胞生物学行为。研究表明肿瘤细胞分泌的外泌体可在肿瘤细胞增殖、血管生成和肿瘤侵袭转移等过程中发挥重要作用。Hca-F和Hca-P是一对来源于同一亲本细胞、具有不同淋巴道转移能力的小鼠腹水型肝癌细胞株,接种于615小鼠足垫后Hca-F细胞的淋巴道转移力高于70%,而Hca-P细胞的淋巴结转移率则低于30%,但其发生机制尚不清楚。我们此前的研究表明,Hca-F和Hca-P细胞表面表达的CXCR4可与615小鼠淋巴结匀浆中的SDF-1a结合,诱导Hca-F和Hca-P细胞分泌基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2),从而促进细胞的迁移和侵袭能力,而且Hca-F细胞表达的CXCR4水平明显高于Hca-P细胞,产生的MMP-9和MMP-2也更多。但外泌体源性CXCR4在小鼠肝癌细胞侵袭转移方面的作用和机制尚未见报道。目的:(1)探讨高转移力Hca-F细胞来源外泌体促进低转移力Hca-P细胞迁移和侵袭能力与趋化因子受体CXCR4的关系;(2)探讨Hca-F细胞来源的外泌体促进淋巴内皮细胞增殖和淋巴管形成能力与CXCR4的关系。方法:(1)无外泌体血清培养Hca-F和Hca-P细胞,通过超速离心(100000g/分钟)提取外泌体(分别标记为F-Exo和P-Exo),应用透射电子显微观察细胞外囊泡的直径和形态,Western blot检测外泌体特有膜表面分子CD63和HSP70蛋白表达,验证提取外泌体的可靠性。(2)利用荧光染料PKH26将F-Exo染成红色,与受体细胞Hca-P(事先用DAPI染核呈蓝色)共孵育,激光共聚焦显微镜下观察受体细胞中带有红色荧光的外泌体摄取情况。(3)利用脂质体Lipofectamine2000转染CXCR4的小干扰RNA(si RNA)(si CXCR4组),以si RNA无关序列(NC组)和Hca-F细胞本身(Control组)作为阴性对照。(4)常规Transwell小室(8.0mm孔径)迁移和侵袭实验分别检测外泌体CXCR4、SDF-1a和淋巴内皮细胞(LEC)孵育对小鼠肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响。(5)使用外泌体形成和释放抑制剂GW4869处理Hca-F细胞后,通过Transwell小室(含0.4mm孔径薄膜,可阻止大于外泌体的颗粒通过)与Hca-P细胞共孵育,检测抑制外泌体分泌对小鼠肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响。(6)应用淋巴管形成实验和CCK-8细胞增殖实验检测外泌体对淋巴内皮细胞增殖和形成淋巴管能力的影响。(7)细胞中和外泌体中CXCR4 m RNA和蛋白表达水平分别通过SYBR Green染料法q RT-PCR和Western blot检测;Western blot检测与转移相关的蛋白MMP-9、MMP-2和VEGF-C的表达水平。结果:(1)透射电子显微镜下可见所提取的囊泡呈球状,直径约30-100 nm,含双层膜,符合外泌体的形态特征;Western blot结果显示外泌体的标记物CD63、HSP70在提取的囊泡中表达明显,b-tubulin则在细胞中表达明显,表明外泌体提取成功。(2)激光共聚焦显微镜下可见细胞核被蓝色荧光染料DAPI标记的Hca-P细胞的胞浆内含有红色荧光染料PKH26标记的外泌体,表明F-Exo可被Hca-P细胞摄取。(3)Transwell小室迁移实验(无基质胶包被)结果显示与Hca-F细胞外泌体共孵育的Hca-P细胞(Hca-P+F-Exo组)穿膜细胞数(400±2.6)显著多于Hca-P细胞本身(228±9.3),差别显著(P<0.05);Transwell小室侵袭实验(基质胶包被)结果显示Hca-P+F-Exo组穿膜细胞数(229±3.8)显著多于Hca-P组(98±5.1),差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示F-Exo中CXCR4蛋白水平明显高于P-Exo,并且与F-Exo孵育的Hca-P细胞(Hca-P+F-Exo组)中CXCR4蛋白表达也显著高于Hca-P细胞本身,但仍略少于Hca-F细胞。(4)Western blot结果显示si CXCR4组CXCR4蛋白水平均显著低于Control组和NC组(P<0.05),表明si RNA转染成功。提取上述三组细胞分泌的外泌体,Western blot检测显示si CXCR4组外泌体(si CXCR4-Exo组)中CXCR4蛋白水平也显著低于阴性对照(Control-Exo组和NC-Exo组)。Hca-P细胞与CXCR4敲低Hca-F细胞外泌体孵育(Hca-P+si CXCR4-Exo组)后,CXCR4蛋白表达显著低于阴性对照(Hca-P+NC-Exo组)。Transwell小室迁移实验(无基质胶包被)结果显示Hca-P+si CXCR4-Exo组穿膜细胞数(365±3.5)显著低于Hca-P+NC-Exo组(503±5.3),差别显著(P<0.05)。Transwell小室侵袭实验(基质胶包被)结果显示Hca-P+si CXCR4-Exo组穿膜细胞数(147±4.2)显著低于Hca-P+NC-Exo组(389±5.7),差别显著(P<0.01)。Transwell小室(含0.4mm孔径薄膜)的上室Hca-F细胞使用外泌体抑制剂GW4869处理,收集下室的Hca-P细胞,Western blot结果显示Hca-P+F-GW4869组CXCR4的表达量显著低于阴性对照DMSO处理(Hca-P+F-DMSO)组;下室Hca-P细胞被转移至具有8.0mm孔径的Tanswell小室,Transwell小室迁移实验(无基质胶包被)结果显示Hca-P+F-GW4869组穿膜细胞数(196±2.5)显著低于Hca-P+F-DMSO组(524±4.3),差别显著(P<0.01);Transwell小室侵袭实验(基质胶包被)结果显示Hca-P+F-GW4869组穿膜细胞数(173±2.2)显著低于Hca-P+F-DMSO组(375±5.4),差别具有显著性(P<0.01)。(5)Transwell小室迁移实验(无基质胶包被)结果显示CXCR4敲低Hca-F细胞与SDF-1a孵育后(si CXCR4+SDF-1a组)穿膜细胞数(92±3.3)显著低于阴性对照Control+SDF-1a组(286±2.1)和NC+SDF-1a组(319±4.1),P值均小于0.05,而与Hca-F细胞本身(Hca-F组,119±4.5)相当。Transwell小室侵袭实验(基质胶包被)结果显示si CXCR4+SDF-1a组穿膜细胞数(52±2.3)也显著低于Control+SDF-1a组(201±5.1)和NC+SDF-1a组(157±4.9),P值均小于0.05,而与Hca-F组(69±2.5)相当。Western blot结果显示,与阴性对照Control+SDF-1a组和NC+SDF-1a组相比,si CXCR4+SDF-1a组MMP-9、MMP-2、VEGF-C蛋白表达显著降低,而与Hca-F组相当。用淋巴内皮细胞代替SDF-1a后,Transwell小室迁移实验(无基质胶包被)结果显示si CXCR4+LEC组穿膜细胞数(103±2.3)显著低于Control+LEC组(307±4.1)和NC+LEC组(319±5.1),P值均小于0.05,而与Hca-F组(132±4.4)无显著差别。Transwell小室侵袭实验(基质胶包被)结果显示si CXCR4+LEC组穿膜细胞数(52±2.3)显著低于Control+LEC组(216±5.1)和NC+LEC组(219±4.6),P值均小于0.05,而与Hca-F组(89±2.7)相当。Western blot结果显示MMP-9、MMP-2、VEGF-C蛋白表达在si CXCR4+LEC组明显低于Control+LEC组和NC+LEC组,与Hca-F组相当。(6)淋巴管形成实验结果显示与CXCR4敲低Hca-F细胞来源外泌体孵育后,LEC形成的管腔数量显著低于阴性对照Control-Exo+LEC组和NC-Exo+LEC组(P<0.01)。CCK-8细胞增殖实验结果显示与CXCR4敲低Hca-F细胞来源外泌体孵育后,LEC增殖速度低于Control-Exo+LEC组和NC-Exo+LEC组(P<0.05)。来自Hca-F细胞的外泌体与CXCR4沉默的淋巴内皮细胞共同培养(LEC-si CXCR4+F-Exo)组,淋巴管形成数量与阴性对照组相比无明显差异(P>0.05);CCK-8实验显示LEC-si CXCR4+F-Exo组与阴性对照组以相似的速率增长。结论:(1)Hca-P细胞可摄入Hca-F细胞分泌的外泌体从而增强其迁移和侵袭能力。(2)Hca-F细胞分泌的外泌体可通过转运CXCR4增强Hca-P细胞迁移和侵袭能力。(3)Hca-F细胞可通过外泌体转运CXCR4,促进淋巴内皮细胞增殖和淋巴管形成,这可能与CXCR4与淋巴内皮细胞表面SDF-1a相互作用,使MMP-9、MMP-2和VEGF-C分泌增多有关。外泌体横向转运CXCR4可能促进肿瘤细胞迁移和侵袭以及淋巴管形成能力,外泌体CXCR4可能成为抑制肿瘤侵袭和淋巴道转移治疗的候选靶点。