第一部分中国大陆地区汉族儿童华法林药物基因多态性研究研究背景华法林是治疗和预防血栓栓塞事件最常用的口服抗凝剂,华法林使用的最大难题是治疗剂量和维持剂量很接近且个体差异大,容易引发出血或栓塞。尽管已知初始剂量和维持剂量的变化取决于体重,年龄,饮食中维生素K的摄入量以及伴随用药,但最近越来越多的研究表明,遗传成分在决定华法林的剂量所占的比例越来越重。在过去十年中,大量研究表明,以下二个基因的多态性主要影响成人的华法林维持剂量:负责华法林S代谢的细胞色素P450 2C9(CYP2C9),维生素K环氧还原酶复合物亚基1(VKORC1)。CYP2C9,VKORC1对成人华法林维持剂量的有重要影响,临床药物遗传学实施联合会于2017年发布了剂量指南,建议使用药物遗传学检测来确定成人的华法林初始剂量。蛋白质的表达和功能(包括药物代谢酶)在婴儿期和儿童期是不断发展的,不同蛋白质的发育速度和模式不同,成人和儿童之间的表型与基因型关系经常不同,因此很难将成人的研究推断给儿童。国际药物遗传学研究报告了基因型对儿童最佳华法林维持剂量的影响。研究表明,CYP2C9和VKORC1这两个基因多态性与儿童华法林维持剂量显着相关。但华法林在儿科的临床应用时间短,循证依据有限,目前儿童抗凝治疗以成人研究为基础而推断的,目前儿童华法林研究存在以下问题:1.世界上儿童华法林研究极少;2.无中国儿童研究;3.不同研究基因型的作用差异大,部分研究基因的作用不及年龄等临床因素;4.各研究年龄层差异大,不同年龄层基因作用可能存在差异;5.除VKORC1和CYP2C9外,其他基因型很少涉及表观遗传学未见报道。目前无中国大陆地区汉族儿童华法林药物基因多态性的研究,为此,本研究对中国大陆地区汉族儿童华法林药物基因CYP2C9、VKORC1进行了大规模的基因多态性研究,为中国儿童进行华法林个体化治疗提供依据。目的及意义华法林是临床上最广泛使用的口服抗凝药,其治疗窗窄,儿童华法林剂量个体间差异大,容易引发出血或栓塞。成人研究表明,CYP2C9和VKORC1基因多态性可显著影响华法林剂量,但世界上儿童华法林研究极少,且目前无中国大陆地区汉族儿童华法林药物基因多态性的研究,本课题旨在研究中国大陆地区汉族儿童华法林药物基因CYP2C9、VKORC1的基因多态性分布情况,为中国儿童进行华法林个体化治疗提供依据。方法随机收集2016年1月至2018年12月于广州市妇女儿童医疗中心就诊的中国大陆地区汉族儿童2622例为研究对象(男1710例、女912例),其中华南地区660例,华东地区655例,华北地区652例,华西地区655例。其中包括川崎病1388例、非川崎病1238例(其中发热非川崎病患儿82例、其他疾病32例、健康对照1124例)。月龄1～176个月,中位月龄25个月。收集年龄、性别、体重、身高和疾病类型等一般临床资料。本研究经广州市妇女儿童医疗中心医学伦理委员会批准(批号:20160730126),所有患儿家属同意并签定书面知情同意书。所有入组儿童,抽取外周静脉血3mL放置于枸橼酸钠抗凝管中,予4℃冰箱保存,5天内用Omega商品化试剂盒提取DNA基因,然后-20℃冰箱保存。待所有者儿童全部收集完毕后,统一通过PCR反应扩增其DNA产物,利用SNaPshot法、焦磷酸测序法和直接测序法等对VKORC1rs9923231、CYP2C9*3rs1057910、VKORC1rs9934438基因进行PCR扩增和序列分析。所有儿童的等位基因分布频率采用Hardy-Weinberg检验方法进行检测。按性别分组,VOKRC1rs9923231,CYP2C9*3 rs1057910、VKORC1rs9934438三个基因型分布的组间比较采用X2检验;按疾病类别进行分组,VOKRC1rs9923231、CYP2C9*3rs1057910、VKORC1rs9934438三个基因型和等位基因分布的组间比较采用X2检验。分析性别及疾病类型与上述基因的基因型和等位基因分布的关系。结果纳入本研究中国大陆地区汉族儿童2622例,基因检测显示VKORC1 rs9923231基因TT、CT、CC基因型的分布频率分别为80.32%、18.38%、1.30%;VKORC1 rs9934438基因AA,AG,GG基因型的分布频率分别为79.94%,18.76%,1.30%。CYP2C9*3rs1057910 基因 AA,AC,CC 基因型的分布频率分别为 92.37%,7.4%,0.23%。按性别分组,三个基因 CYP2C9*3 rs1057910、VOKRC1 rs9923231、VOKRC1 rs9934438基因型基因的基因型分布组间比较差异均无统计学意义(均P>0.05),即性别对中国汉族儿童VOKRC1 rs9923231、VOKRC1rs9934438和CYP2C9*3 rs1057910基因型分布无影响。按疾病类型分为川崎病组(n=1388)和对照组(n=1238),VOKRC1 rs9923231、VOKRC1rs9934438和CYP2C9*3 rs105791的基因型及等位基因分布组间比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论1.中国大陆地区汉族儿童华法林基因CYP2C9*3rs1057910以野生型为主,而华法林基因VKORC1 rs9934438和rs9923231以变异型为主;2.性别及疾病分类对中国大陆地区汉族儿童VOKRC1 rs9923231、VOKRC1rs9934438和 CYP2C9*3 rs1057910基因型分布无影响;3.中国大陆地区汉族儿童VKORC1 rs9923231、CYP2C9*3 rs1057910和VKORC1 rs9934438基因型及等位基因突变率和国外华裔人群相似,但与高加索人群有明显差异;4.儿童华法林药物基因的多态性与华法林剂量,出血及血栓等并发症状密切相关,儿童华法林用药前,需进行华法林药物基因组学检测,有助于安全、有效地个体化治疗。第二部分基因多态性及microRNA联合调控下的儿童华法林个体化用药模型的研究研究背景川崎病导致的冠状动脉瘤(CAA),易并发冠状动脉血栓、狭窄甚至闭塞,可导致缺血性心肌病,其已经成为儿童获得性心脏病的最常见原因。指南建议川崎病合并冠状动脉巨大瘤的患儿需长期口服华法林治疗。然而,儿童华法林治疗窗窄,难以达到稳态剂量,与成人不同,目前国际上没有儿童华法林统一用法标准及预测剂量公式,儿童华法林的用法仅仅基于有效的临床经验,难以达到稳定剂量,且易出现出血及血栓等并发症。华法林剂量达稳态与遗传基因学密切相关,有人种差别,儿童和成人也有差别,不同个体服用药物剂量相差20倍以上,限制了华法林在儿童中的广泛应用。目前无中国儿童川崎病冠状动脉瘤患儿华法林剂量达稳态计算公式。本文联合基因多态性、microRNA,临床等因素,探讨川崎病并发冠状动脉瘤患儿华法林用法用量及稳定剂量,通过多元回归分析得出中国儿童华法林稳定剂量的主要影响因素,尝试建立儿童华法林用法剂量计算模型,为儿童临床合理个体化华法林治疗提供依据。目的对于患有川崎病导致的巨大冠状动脉瘤的儿童,需要使用华法林抗凝治疗。但因儿童华法林个体差异较大,难以预测华法林剂量。成人研究表明,维生素K环氧合酶还原酶1(VKORC1)和细胞色素P4502C9(CYP2C9)的基因多态性影响华法林剂量的主要基因。我们研究了 VKORC1、CYP2C9基因型和microRNA对川崎病导致的巨大冠状动脉瘤患儿的华法林剂量的影响,结合性别、年龄、体重,体表面积等临床因素,通过变量回归分析评价影响中国儿童华法林稳定剂量的主要因素,试图建立儿童华法林用法剂量模型,为中国儿童华法林个体化治疗提供依据。方法1、病例纳入标准①在我院诊断川崎病合并冠状动脉巨大瘤的患儿或冠状动脉短期内急剧扩张并有血栓样回声者;②药物依从性佳且可以坚持长期随诊;③口服稳定剂量华法林≥2个月,同时期目标国际化比值比(INR)稳定在1.5～2.5≥2个月;④肝功能、肾功能、电解质、血常规、尿常规指标均在正常值范围者。2、排除标准可能存在其他导致冠状动脉瘤的疾病,如多发性血管炎、慢性EB病毒感染等。3、选择了 CYP2C9*2(rs1799853)、CYP2C9*3(rs1057910)、VKORC1(rs9923231)、miRNA133a-2-191G>A 基因位点的多态性进行检测并分组分析,CYP2C9再分为AA型、AC型和CC型,VKORC1 rs9923231 再分为 TT 型、TC 型和 CC 型。miRNA133a-2-191G>A 再分为GG型,GA型和AA型。在华法林用药前和用药后后行上述基因检测,分为华法林治疗前基因检测和治疗后基因检测组。4、华法林药物基因多态性的检测采集患儿外周静脉血3 mL(已用二胺四乙酸抗凝),使用TaqMan实时聚合酶链反应对VKORC1(rs 9923231)和CYP2C9*3(rs 1057910),CYP2C9*2(rs1799853)及 miRNA133a-2-191G>A进行基因分型,操作按照试剂盒说明书进行。根据CYP2C9*2、CYP2C9*3、VOKRC1,miRNA133a-2-191G>A序列设计引以野生型作为参考序列,采用SNaPshot法、焦磷酸测序法和直接测序法等对VKORC1(rs 9923231),CYP2C9*3(rs1057910),CYP2C9*2(rs1799853)及miRNA133a-2-191G>基因进行PCR扩增和序列分析。5、记录患儿的临床和遗传数据。进行了多元回归分析以评估临床和华法林基因多态性对华法林维持剂量的影响。结果1.基因型之间的比较VKORC1的CT或CC基因型患儿(rs9923231)华法林剂量要比TT基因型患儿高(0.130±0.033 vs.0.103±0.030mg/kg.d,p<0.05)。只有 3 例患儿携带CYP2C9*3等位基因(rs1057910),其华法林剂量低于野生CYP2C9*1/*1 基因型(0.127±0.039 vs.0.107±0.032 mg/kg.d,p>0.05)。合并 VKORC1 CC/CT和CYP2C9*1/*1的患儿基因型的华法林剂量高于VKORC1 TT的和CYP2C9*1/*1 基因型(0.127±0.336vs.0.104±0.292mg/kg·d,p<0.05)。其他基因型之间没有发现显着差异。具有VKOCR1 TT基因型的患儿达到目标INR 比具有CT或CC基因型的人更早(10.38±8.88 vs.27.89±15.70 天,p<0.01)。CYP2C9*1/患儿和*1/*1患儿,在相同时间达到了目标 INR(13.23±.12.47vs.25.67±2.08 天,p>0.01)。miRNA133a-2-191G>A GG、GA、AA 基因型频率分别为 94.6%、3.2%和1.2%,具有miRNA133a-2-191G>A三种基因型的患儿,均对华法林稳态剂量没有显著影响。2.临床和遗传变量对华法林剂量的影响在多变量回归分析中,华法林剂量与年龄,体重,身高,体表面积和VKORC1显着相关基因型。CYP2C9基因型和miRNA133a-2-191G>A基因型的INR没有统计学意义。将候选变量输入到最终的多元回归分析中。体重和VKORC1基因型占最终模型总变异的44.2%。与VKORC1基因型相比,体重对华法林剂量的影响更大(分别为33.0%和11.2%)。体重与华法林剂量呈负相关(r=-0.58,p<0.05)。3.儿童华法林剂量模型预测中国儿童华法林剂量的预测算法如下:华法林每日剂量(mg/kg)=0.133-0.002*体重(kg)+0.026*VKORC1(VKORC1:CC/CT 类型为 1;TT 类型为 0)结论1.体重和VKORC1基因型主要决定了中国儿童川崎病患儿的华法林剂量。2.CYP2C9基因型和miRNA133a-2-191G>A基因型对中国儿童川崎病的华法林剂量无明显影响。3.基于体重和VKORC1基因型的儿童华法林剂量模型有助于准确预测儿童华法林所需剂量。4.该华法林剂量模型的有效性必须在具有不同适应症的其他种族的人群中进行验证。