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目的:自噬作为细胞的一种自我修复机制,在骨性关节炎的病理过程中得到高度关注。本文主要研究IL-1Ra对人骨性关节炎软骨细胞噬的调控机制,并探讨通过IL-1Ra与自噬增强剂协同作用,增强IL-1Ra对软骨细胞抵抗损伤的可行性。方法:1、探讨IL-1Ra对人骨性关节炎软骨细胞的影响:首先将人OA软骨分为4组,分别为对照组,IL-1β处理组,IL-1Ra,IL-1及IL-1Ra共处理组。(1)Western blotting观察各组基质代谢相关指标及自噬蛋白水平的变化。(2)提取RNA,real-time PCR检测各组mRNA水平变化。(3)激光共聚焦显微镜观察各组自噬泡的形态变化的变化。(4)电镜观察各组自噬泡的形态变化。2、探讨IL-1Ra对骨性关节软骨细胞的作用机制:首先将人OA软骨分为4组,分别为对照组,IL-1β处理组,IL-1Ra,IL-1β及IL-1Ra共处理组。(1)通过核质分离手段分别得到细胞核和细胞质,用western blot方法分别检测细胞核和细胞质内的自噬水平。(2)通过核质分离手段分别得到细胞核和细胞质,免疫沉淀的方法检测软骨细胞核内的LC3B蛋白乙酰化水平。(3)western blot方法检测Akt、mTOR、ULK1、NF-kB信号通路蛋白表达水平变化。3、探讨自噬增强剂对人骨性关节炎软骨细胞的作用:(1)将人骨性关节炎软骨细胞分为对照组及自噬增强剂TAT-beclin-1处理组,western blot方法检测各组基质代谢相关指标及自噬蛋白水平变化。(2)将IL-1β处理的人骨性关节炎软骨细胞分为对照组,IL-1Ra组,TAT-beclin-1组,IL-1Ra与TAT-beclin-1联合处理组,用western blot方法检测各组基质代谢相关指标及自噬蛋白水平变化。4、采用前交叉韧带离断+内侧半月板部分切除术建立SD大鼠骨性关节炎模型;在术后两周内,每周2次关节腔内别分注射生理盐水、TAT-beclin-1、IL-1Ra、IL-1Ra与TAT-beclin-1混合液。造模SD大鼠药物注射完成后,分别于术后三周、五周脊柱脱臼处死。(1)各处理组标本切片后行HE染色及番红O固绿染色,采用OARSI评分处理。(2)各处理组标本切片行免疫组化方法检测软骨细胞基质蛋白与自噬相关指标变化。结果:1、(1)Westem blotting结果显示IL-1Ra提高了人OA软骨细胞CollagenⅡ、Aggrecan、Beclin1、LC3B 的蛋白水平;(2)real-time PCR 显示 IL-1Ra 提高了人OA软骨细胞LC3B、Beclin1的mRNA水平;(3)免疫荧光结果显示IL-1Ra促进了人OA软骨细胞自噬泡形成(4)电镜结果显示IL-1Ra促进了人OA软骨细胞自噬泡形成。2、(1)人OA软骨细胞质中IL-1Ra提高了 LC3B-Ⅱ的蛋白表达,同时在细胞核中联合组LC3B较IL-1β组也有所下降;(2)IL-1β处理确实显著性提高了核内LC3的乙酰化水平,而IL-1Ra与IL-1β联合组的核内LC3B乙酰化水平则较IL-1β 组低;(3)IL-1β 与 IL-1Ra 联合处理组 p-Akt、p-mTOR、p-ULK1(ser757)蛋白水平明显较IL-1β组低;(4)IL-IRa能够降低人OA软骨细胞P65蛋白水平,同时IL-1Ra能够抑制P65蛋白转移入细胞核内。3、(1)TAT-Beclin-1 提高了人 OA 软骨细胞 CollagenⅡ、Aggrecan、LC3B 蛋白水平;(2)IL-IRa 与 TAT-Beclin-1 联合组则较 CollagenⅡ、Aggrecan、LC3B 蛋白水平较IL-1Ra、TAT-Beclin-1组增加。4、动物实验结果显示:(1)HE&番红O染色:IL-1Ra、TAT-Beclin1联合注射治疗组软骨厚度大于其余造模组。OARSIOA评分结果显示:联合注射治疗组评分低于其余造模组,IL-1Ra、TAT-beclin-1注射治疗组评分低于理盐水注射组及造模组。(2)免疫组化结果显示:在三周组内,造模后注射治疗药物(IL-1Ra、TAT-beclin-1、联合注射组)各项检测指标均高于生理盐水注射组。同时,联合注射组的Aggrecan、Beclin1与LC3B表达量高于其余造模组。五周组内,造模后注射治疗药物(IL-1Ra、TAT-beclin-1、联合注射组)各项检测指标同样均高于生理盐水注射组,其中联合注射治疗组LC3B表达量高于其余各造模组,但其余指标较IL-1Ra、TAT-beclin-1治疗组没有明显区别。结论:IL-1Ra可以通过调控Akt/mTOR/ULK1、Akt/NF-κB信号通路、以及LC3B蛋白去乙酰化,从而促进骨性关节炎软骨细胞外基质合成,提高其自噬水平,保护软骨细胞作用,抑制骨性关节炎病理进展。IL-1Ra与自噬增强剂TAT-Beclin-1协同作用,明显提高IL-1Ra保护人OA软骨细胞的功效。