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前言 小细胞肺癌是恶性度极高的肿瘤，早期即发生淋巴及血行转移是其重要的临床特点，目前临床上尚无确实有效的治疗方法，期待基因治疗法能够带来新的突破。小细胞肺癌的转移是多基因参与的多步骤的复杂过程，虽有3号染色体短臂部分区域(3p14-23)的缺失，Rb基因及其蛋白的表达异常等这些小细胞肺癌相关基因，但仍远远不能解释小细胞肺癌复杂的临床表现及生物学行为，特别是对小细胞肺癌早期即发生转移和与转移相关的基因目前了解甚少。因此，筛选用于基因治疗为目的的靶基因和外源基因成为基因治疗研究的热点。小细胞肺癌的基因治疗主要应着眼于阻断转移途径的研究，所以迫切需要筛选出更多的小细胞肺癌的转移相关基因。1992年，梁鹏和Pardee建立了一种新的显示mRNA差异表达的技术，称为mRNA差异显示(mRNA Differential display)或差异显示反转录PCR(Differential display RT-PCR)。DD-PCR的优点非常明显：几乎可以检测细胞表达的所有基因，可以同时比较多种细胞类型、展现所有差异、检测基因的上调和下调表达。在过去几年里，出现了许多技术方面的改进，主要集中在增加对于差异表达基因鉴定的效率和降低对于基因鉴定的工作量俩个方面。随着mRNA-DD方法日趋成熟，使其在生物医学领域，特别是在病理生理过程寻找新基因的工作中得到了广泛应用。本研究中，我们利用mRNA荧光差异显示技术(mRNA Fluorescence differential display，mRNAFDD)对手术切除的小细胞肺癌原发癌和淋巴结转移癌的标本中基因表达差异进行研究，为小细胞肺癌的转移相关基因筛选提供思路，也为mRNA差异显示技术更加成熟的应用提供借鉴。 目的 应用mRNA荧光差异显示技术，筛选人小细胞肺癌的转移相关基因片段，为今后小细胞肺癌转移机制的研究提供思路。同时，进一步完善mRNA差异显示技术平台。实验材料 1.实验材料:标本来源于中国医科大学附属一院胸外科手术切除的五例小细胞肺癌标本，术中切取肺原发癌及淋巴结转移癌组织。术后经病理验证确实为小细胞肺癌。 2.实验试剂:本实验应用锚定引物T7(dT12)APs和随机引物M13r一ARPs。RNA提取(TRIZOL)、逆转录试剂盒为GIBCOBRL公司产品;PCR试剂盒为TaKaRa公司产品;Genom弃荧光差异试剂盒及主要仪器设备Genomyx DNA电泳及荧光扫描系统为美国BECKMAN公司产品。 3.主要仪器设备:LMZoo激光显微细胞俘获系统，自动电泳凝胶成像分析仪，台式低温高速冷冻离心机，PCR扩增仪，GenoIDyx LR DNA电泳系统及Genomyx SC荧光扫描分析系统。实验方法 1.应用Pix cen n LCM激光显微细胞俘获系统分别提取小细胞肺癌原发癌和淋巴结转移癌的单纯癌细胞各约8(XX)个。 2.Trizol法分别提取小细胞肺癌原发癌与淋巴结转移癌的RNA。将LCM捕获细胞的帽盖于预先加有200川Trizol试剂的0.SlnlEppendoff管上，倒置离心管，室温静置30min，加40闪氯仿剧烈振荡巧秒后室温静置15min，离心4℃11000转巧min，将上清液移至另一新管加100闪异丙醇混匀，一70℃放置30而n后离心4℃n000转10而n，弃上清，加人75%DEPC乙醇200闪漂洗，离心4℃fl000转smin，弃上清空气干燥巧min，沉淀溶于经DEPC处理的去RNA酶水中，55℃水浴中孵育10面n，所得样品置-70℃保存。 3.cDNA第一链的合成(RT一PCR):PCR热循环仪中应用锚定引物-竹(dT12)APg，竹(dT12)AP12，分别合成原发癌和淋巴结转移癌的cDNA第一链。 4.PCR( DD一PCR):以逆转录合成的cDNA第一链为模板，用锚定引物一TMR一竹(dT12)A即，TMR一，I7(dT12)AP12和随机引物M13r-ARPI一4进行PCR扩增，反应条件:95℃2而n预变性，92℃巧S变性，50℃305复性，72℃Zmin延伸共4个循环，92℃155变性，60℃305复性，72℃2面n延伸共30个循环。 5.差异条带回收及再扩增DDRT一代R产物在C七no功yx LR DNA电泳系统中以3仪x〕v，loow，55℃电泳4h。侥no贝yxSC荧光扫描分析系统采集并分析图象，选择差异表达的电泳条带，在切胶工作台上切取差异条带并回收DNA片段。切下的凝胶放人1 .sd离心管中，加人50户无菌无核酶的TE液，37℃水浴印面u后，一20℃待用。以4闪此TE液为模板，竹Pmm仗-er及M13 Rev~为引物，反应体系同前，对回收的DNA片段进行再扩增。 6.纯化及序列分析再扩增DDRT一PCR产物进行1%琼脂搪电泳，切取再扩增出的胶带，于提纯离心管中离心12以犯g巧而n，得到的纯化DNA片段送侧序。实.验结果 1.本实验共用了2条锚定引物进行cDNA第一链合成，选用4种随机引物进行DDRT一PCR差异显示分析。从DDRT一PCR电泳结果图中，可见数条cDNA差异带，我们选择其中2条差异条带S1，S2(其中Sl在癌组织中高表达，s2在琳巴结转移癌组织中高表达)进行分析，可以推测Sl片段可能参与小细胞肺癌的转移抑制，S2片段可能是小细胞肺癌的转移基因。 2.通过对差异显示技术一系列条件的探索和改进，建立了有效的DDRT一代R法。结论 1.小细胞肺癌原发癌和淋巴结转移癌在基因表达方面存在差异。 2.本研究筛选的两个