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鲍氏层孔菌(Phellinus baumii Pilat)为担子菌亚门(Basidiomycotina)、锈革孔菌科(Hymenochaetaceae)、针层孔菌属(Phellinus)的珍稀药用真菌。其子实体俗称桑黄,为我国传统中药材。近年来的研究表明,其子实体提取物具有抗肿瘤、免疫刺激、抗突变、降血糖、抗氧化和清除自由基等活性。到目前为止,人们对鲍氏层孔菌的研究大多数集中在子实体的粗多糖的研究,而对液体培养的鲍氏层孔菌菌丝体多糖(PBMP)的分离纯化、理化性质以及结构特征进行深入研究的报道甚少。传统上,鲍氏层孔菌的活性成分多糖通常从子实体中提取；但由于鲍氏层孔菌野生资源(子实体)的日益匮乏,加之人工栽培周期长、难度较大,这已限制了对该菌的进一步开发和利用。而液体深层发酵具有周期短、菌丝体多糖产量高、条件控制容易、污染少、便于发酵下游加工处理以及工业化大规模生产等特点,是大量获取菌丝体多糖的理想途径,因此,采用液体深层发酵方法是目前开发鲍氏层孔菌活性成分的一条有效途径。为了系统的研究鲍氏层孔菌菌丝体多糖的化学结构和生物活性,本研究对鲍氏层孔菌进行了液体深层发酵培养,并对其菌丝体多糖进行了提取、分离纯化、结构鉴定和药理活性进行研究。本论文共有四个部分,分别从菌丝体的深层发酵条件优化、多糖分离纯化、理化性质和结构鉴定、体外清除自由基、体内对半乳糖诱导的衰老小鼠氧化应激的影响以及免疫调节和体外抑瘤活性进行了研究。主要结果如下：1液体培养的鲍氏层孔菌多糖发酵条件的优化运用2(7-3)部分因子设计(FFD)筛选出影响鲍氏层孔菌菌丝体多糖产量的关键因素：葡萄糖、蛋白胨、酵母膏及硫酸镁；采用响应曲面设计中的中心组合设计(CCD)对有显著影响菌丝体多糖产量的关键因素水平进行优化,确定培养基的组成分别为(g/1)：葡萄糖35.36,酵母膏2.88,蛋白胨2.73,MgSO41.47, KH2PO41, VBi 0.0075,草酸铵0.3。在优化的培养基基础上,运用中心组合设计对鲍氏层孔菌液体发酵的温度和pH进行优化,筛选出了鲍氏层孔菌液体发酵的温度和pH的条件为分别为28℃、6.0。在培养基成分、温度和pH优化基础上,对P. baumii Pilat分批发酵过程中的相关指标(菌丝体多糖产量、菌丝体生物量、残糖、pH值)的动态变化规律进行研究。结果表明,在发酵进行144 h时菌球生长良好,菌丝体干重、菌丝体多糖产量达到最大值,分别为13.69 g/l、0.94 g/l。由此可见,利用数理统计方法对鲍氏层孔菌菌丝体多糖产量的发酵条件优化是经济可行,科学合理。2鲍氏层孔菌菌丝体多糖提取、分离纯化、理化性质及结构分析液体发酵得到的菌丝体经干燥、粉碎、水提、75%乙醇沉淀、离心,然后用无水乙醇、丙酮以及乙醚洗涤、干燥,即得到鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖。多糖的提取率为6.72%。运用DEAE-纤维素-52阴离子交换柱层析法对鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖进行初步分离,初步得到三个纯化组分F1、F2和F3；再利用葡聚糖G-100凝胶过滤柱层析法对初步纯化组分F1,F2和F3进行进一步纯化,得到鲍氏层孔菌菌丝体多糖纯化组分PBMP-1、PBMP-2a、PBMP-2b和PBMP-3四个组分,其得率分别为32.57%、4.13%、5.08%和0.79%。采用苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝法和硫酸-间羟联苯法测定了PBMP-1、PBMP-2a、PBMP-2b和PBMP-3四个多糖组分的总糖、蛋白质和糖醛酸含量,其总糖含量分别为99.49%、77.02%、92.03%和71.19%；蛋白质含量分别为未检出、4.99%、1.54%和4.45%,糖醛酸含量分别为2.01%、3.74%、4.29%和5.27%。采用高效液相凝胶渗透色谱法(HPGPC)对PBMP-1、PBMP-2a、PBMP-2b和PBMP-3的相对分子量进行测定,并对其纯度进行进一步鉴定。结果表明PBMP-1、PBMP-2a、PBMP-2b和PBMP-3四个组分都是均一的多糖组分,且其分子量分别为2.95×103kDa、1.17×103kDa、16.29kDa和1.54×103 kDa。通过糖腈乙酸酯衍生物的气相色谱法测定了4个多糖组分的单糖组成：PBMP-1由3种单糖组成,其摩尔比为：岩藻糖：葡萄糖：半乳糖=1.00:24.54:0.29; PBMP-2a由4种单糖组成,其摩尔比为：岩藻糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖=0.56：0.76：3.23：1.00; PBMP-2b由4种单糖组成,其摩尔比为：岩藻糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖=0.23:1.29:1.00:1.01; PBMP-3由5种单糖组成,其摩尔比为：鼠李糖：岩藻糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖=0.52：0.58：2.51：1.44：1.00。FTIR技术研究表明：PBMP-1. PBMP-2a和PBMP-2b三个组分的糖环形式均为吡喃糖环;PBMP-1的糖苷键构型均为α型,PBMP-2a和PBMP-2b的糖苷键构型既有α型又有β型。UV扫描表明：PBMP-2a和PBMP-2b中具有少量蛋白质,而PBMP-1中不含蛋白质。高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反应、GC/MS以及NMR技术研究表明：PBMP-1多糖组分的基本结构：α型糖苷键构型连接,以1,4-葡萄糖残基和1,6-半乳糖残基构成主链,同时以岩藻糖为非还原末端、含有1,3,4-葡萄糖分支和1,4,6-葡萄糖分支等高度分支的不均一多糖；PBMP-2a含有α和β型糖苷键,并以α型糖苷键为主要连接类型,是以1,4-葡萄糖残基和1,6-半乳糖残基构成主链,以少量的岩藻糖、葡萄糖和甘露糖为非还原末端,并带有1,6-葡萄糖分支、1,3,4-葡萄糖分支、1,4,6-葡萄糖分支、1,2-甘露糖分支、1,2,6-甘露糖分支的复合多糖；PBMP-2b含有α和β型糖苷键,并以α型糖苷键为主要连接类型的复合多糖,是以1,2,6-甘露糖残基和1,3,4-葡萄糖残基构成多分支的主链,并在甘露糖C6位、葡萄糖C3位上面连接岩藻糖或甘露糖或葡萄糖与1,6-半乳糖构成的侧链。3鲍氏层孔菌菌丝体多糖清除自由基作用及其对半乳糖诱导的衰老小鼠氧化应激影响采用化学方法分别研究了鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖PBMP及其纯化组分PBMP-1的体外清除02·自由基、OH·羟基自由基以及抑制脂质过氧化反应活性。结果表明,鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖PBMP及其纯化组分PBMP-1能够清除超氧阴离子自由基02·、羟基自由基OH-,并抑制脂质过氧化的发生,而且粗多糖较纯化的多糖组分具有较强的活性。运用D-半乳糖诱导的衰老动物模型,考察了鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖PBMP及其纯化组分PBMP-1对半乳糖引起的小鼠氧化应激反应的影响。结果发现,注射D-半乳糖可引起机体氧化损伤,显著增加肝脏和血清中MDA含量,明显降低肝脏和血清中抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活性以及非酶抗氧化能力TAOC水平。而应用鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖PBMP及其纯化组分PBMP-1处理,可减弱D-半乳糖诱导的氧化应激反应,显著提高肝脏和血清中SOD活性、CAT活性、GSH-Px活性以及TAOC水平,显著降低肝脏和血清中MDA含量,且呈现明显的剂量依赖关系。同时,不同剂量的鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖PBMP组、纯化组分PBMP-1组能明显提高衰老小鼠的胸腺指数和脾指数,这可能与其提高机体抗氧化活性,减轻自由基对生物膜的损害,从而保护机体及免疫器官免受自由基攻击有关。4鲍氏层孔菌菌丝体多糖的免疫调节与体外抑瘤活性研究采用体外脾细胞模型研究分析了鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖及其纯化组分PBMP-1、PBMP-2a、PBMP-2b和PBMP-3的免疫活性。结果显示鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖PBMP及其纯化组分PBMP-1、PBMP-2a和PBMP-2b对不加有丝分裂原刺激的脾细胞具有促进增殖作用；同时对ConA诱导的小鼠T淋巴细胞增殖与LPS刺激的B淋巴细胞增殖均有一定协同作用,且刺激程度存在一定的差异。而纯化组分PBMP-3对单独或有有丝分裂原刺激的脾细胞增殖均没有促进作用,反而具有一定的免疫抑制作用。采用体外巨噬细胞模型研究分析了鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖及其纯化组分PBMP-1、PBMP-2a、PBMP-2b和PBMP-3的免疫活性。鲍氏层孔菌菌丝体多糖具有提高腹腔巨嗜细胞酸性磷酸酶活性、增强腹腔巨嗜细胞吞噬中性红能力,且这种作用与多糖浓度在一定范围内呈正相关的量效关系。采用MTT法对鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖PBMP及其纯化组分PBMP-1、PBMP-2a、PBMP-2b和PBMP-3在体外抑制人胃癌BGC-823细胞增殖作用进行研究。结果表明,鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖PBMP及其纯化组分PBMP-1、PBMP-2a. PBMP-2b和PBMP-3作用24、48、72 h,均能不同程度的抑制BGC-823细胞的增殖,且抑制作用与多糖之间存在明显正相关的量效关系和时效关系。在50μg/ml浓度、作用72 h时,PBMP-1、PBMP-2a、PBMP-2b和PBMP-3等多糖组分对BGC-823的体外抑瘤率达到81.98%、90.68%、90.27%和90.05%,已经接近阳性对照(顺铂,5μg/ml)的抑制率(95.30%),均表现出较强的抑制BGC-823增殖作用。