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背景和目的生长激素垂体腺瘤(Growth hormone-secreting pituitary adenomas,GHPAs)是一种难治性颅内肿瘤,分泌高水平生长激素,激发胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factors,IGF1)增高,导致肢端肥大症或巨人症,继发肥厚性心肌病、内分泌紊乱、糖耐量降低等,增加患结肠息肉、结肠癌及甲状腺癌等风险。GHPAs直接压迫邻近组织结构,导致视神经损害及垂体机能减退症等。目前,最主要的治疗方法是手术切除,但约占30%GHPAs向侧方生长,侵袭肿瘤旁海绵窦结构,损害其内展神经、动眼神经、滑车神经、眼神经等,挤压或包裹颈内动脉,向上分叶性生长,破坏鞍隔和视交叉等,这就是侵袭性垂体生长激素腺瘤(Invasive growth hormone-secreting pituitary adenomas,IGHPAs)显著临床特征。IGHPAs难以被完全切除,残留的肿瘤继续生长,导致高水平的IGF1不能得到有效纠正,肿瘤仍然侵袭邻近神经、血管、垂体组织等结构,形成恶性循环,使得预后较差。至今,GHPAs侵袭性是一治疗难题,对其发生发展的相关因素及机制不清楚,因此研究GHPAs侵袭性显得尤为重要。按照WHO垂体肿瘤病理分型标准,GHPAs病理诊断主要依据肿瘤细胞分泌的生长激素免疫组化染色和生长激素细胞系标记物阳性表达。GHPAs侵袭性的判断主要采用基于术前鞍区MRI检查结果的Knosp评级标准及手术中所见的肿瘤侵袭海绵窦情况。根据电镜下超微结构表现,GHPAs又分为稀疏颗粒型和致密颗粒型。我们在观察GHPAs超微结构时发现IGHPAs与非侵袭性生长激素垂体腺瘤(Non-invasive growth hormone-secreting pituitary adenomas,NIGHPAs)之间的线粒体数量和形态存在差异。乳酸脱氢酶A(Lactate dehydrogenase A,LDHA)是抑制有氧呼吸增强无氧糖酵解的关键限速酶,其高表达提示肿瘤存在异常能量代谢改变。而线粒体作为细胞能量代谢主要场所,可能伴随差异性改变。既往研究表明LDHA在IGHPAs表达高于NIGHPAs,提示GHPAs侵袭性与异常能量代谢改变相关。另一些研究表明乳腺癌的侵袭和转移与线粒体功能密切相关。因此,推测线粒体数量和形态与GHPAs侵袭性存在关联性。体视学既是一门形态学又是统计学,为比较IGHPAs与NIGHPAs之间线粒体形态和数量差异提供有力科学依据。线粒体数量和形态由其形态过程相反的分裂和融合功能所调控,分别主要受发动蛋白(Dynamin-related protein 1,Drp1)和融合蛋白(Mitofusin 2,Mfn2)所介导。干预Drp1和Mfn2蛋白表达可以调控线粒体分裂或融合行为,导致线粒体数量改变。信号传导和转录激活因子3(Signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)存在两个重要亚基Y705和S727。既往研究表明STAT3通过上游非受体型酪氨酸蛋白激酶(Janus Kinase,JAK)激活Y705,组成JAK-STAT3信号通路,发挥信号传导和转录作用,参与调控肿瘤侵袭、增殖等。最近文献报道STAT3存在旁路信号激活通路,通过其亚基S727被活化而发挥作用,进而参与线粒体氧化呼吸作用,但具体机制仍然不清楚。细胞基质金属蛋白酶2/9(Matrix metalloproteinase 2 and 9,MMP2/9)是STAT3下游重要的激活分子,从而促进肿瘤细胞侵袭。既往研究表明MMP2/9活性与垂体腺瘤(Pituitary adenomas,PAs)侵袭性呈正相关。本研究将探讨线粒体形态和数量与GHPAs肿瘤细胞侵袭和增殖相关性及线粒体分裂与STAT3活化相关性,从而提示能量代谢与肿瘤发生发展及生物行为改变相关,进而为IGHPAs的药物治疗提供思路。方法1.电镜下观察线粒体结构,结合体视学方法分析侵袭性(侵袭组)和非侵袭性生长激素垂体腺瘤(非侵袭组)的线粒体的Nv、Vv、Sv,比较之间线粒体形态和数量差异性。2.采用RT-q PCR和蛋白免疫印迹法(Western blotting,WB)等方法检测侵袭组和非侵袭组Drp1、Mfn2、LDHA表达,比较之间差异。3.用大鼠GH3细胞系进行体外实验,以慢病毒转染GH3细胞,上调Drp1蛋白表达为上调组,促进线粒体分裂,以慢病毒空载体转染为对照组,用Mdivi-1抑制Drp1活性为抑制组,抑制线粒体分裂,结合Transwell实验和细胞增殖实验观察上调组和抑制组之间侵袭性和增殖差异改变。4.采用WB检测侵袭组和非侵袭组STAT3、p-STAT3(Y705)、p-STAT3(S727)蛋白表达,并用同样方法检测侵袭组和非侵袭组STAT3蛋白表达,再结合免疫组化(IHC-P)检测p-STAT3(Y705)、p-STAT3(S727)蛋白表达;利用金属蛋白酶MMP2/9原位荧光检测试剂盒检测上调组与抑制组MMP2/9活性;分别采用STAT3特异性抑制剂HO-3867抑制Y705和S727磷酸化和隐丹参酮(Cryptotanshinone,Cry)抑制Y705磷酸化,检测MMP2/9活性,观察侵袭和增殖改变情况。5.培养垂体生长激素原代细胞(Primary cell of growth hormone pituitary adenomas,PAPCs),设置原代细胞对照组(PAPC)、原代细胞+Mdivi-1(PAPC+Mdivi-1)和原代细胞+Mdivi-1+STAT3药物抑制组(PAPC+Mdivi-1+HO-3867,PAPC+Mdivi-1+Cry),用Transwell实验和细胞增殖实验观察组间侵袭性和增殖差异。结果1.相对于NIGHPAs,IGHPAs肿瘤细胞线粒体数量减少,并伴有LDHA表达增高电镜下观察发现非侵袭组具有部分呈分裂形态的线粒体,而侵袭组较少。两组线粒体双层膜结构完整,非侵袭组内膜嵴呈现较清楚,而侵袭组内膜嵴较模糊。采用体视学方法分别获得侵袭组较非侵袭组线粒体的Nv、Vv、Sv均减少,结果表明侵袭组线粒体数量减少。同时RT-q PCR检测结果表明侵袭组LDHA表达增高,提示侵袭组的线粒体分裂和数量的减少合并能量代谢异常改变。2.在GH3细胞系体外实验中抑制线粒体分裂,促进肿瘤细胞侵袭和增殖侵袭组Drp1表达低于非侵袭组,而Mfn2表达在两组之间未见明显差异;侵袭组LDHA蛋白表达高于非侵袭组;在大鼠GH3细胞体外试验中Drp1上调组侵袭性降低,抑制组侵袭性增强。抑制组GH3细胞增殖能力较对照组增强,过表达组降低;抑制组和过表达组细胞周期G0/G1期均增高,G2/S期均减少,结果表明抑制或促进线粒体分裂均促进GH3细胞增殖;抑制组细胞凋亡、MMP、ROS及Bax和Caspase3蛋白表达均降低,Bcl-2蛋白表达增高,上调组细胞凋亡、MMP、ROS及Bax和Caspase3蛋白表达均增高,Bcl-2蛋白表达降低,结果表明线粒体分裂的抑制降低线粒体介导的凋亡,增强肿瘤细胞抗死亡能力,促进增殖。3.在GH3细胞系体外实验中抑制线粒体分裂伴有STAT3-MMP2/9信号激活,STAT3的激活降低胞内ROS,稳定MMP,抑制线粒体凋亡途径侵袭组和抑制组STAT3、p-STAT3(Y705)、p-STAT3(S727)蛋白表达增高,非侵袭组和上调组表达降低,结果表明线粒体分裂的抑制伴有STAT3的激活。抑制组MMP2/9活性强于上调组,但能被STAT3抑制剂所阻断,并伴有侵袭性减弱,表明线粒体分裂的抑制伴有STAT3的激活,增强MMP2/9活性,介导肿瘤细胞侵袭性。VE+Mdivi-1+HO-3867组细胞增殖能力较对照组VE+Mdivi-1明显降低,VE+Mdivi-1+Cry组比对照组VE+Mdivi-1无差异,结果表明STAT3亚基S727磷酸化在抑制线粒体分裂介导GH3细胞的增殖过程中发挥重要的促进作用;在线粒体分裂被抑制条件下通过抑制STAT3磷酸化并未引起GH3细胞周期改变;相对于对照组VE+Mdivi-1,VE+Mdivi-1+HO-3867组细胞凋亡、MMP、ROS、Bax/Bcl-2、Caspase3蛋白表达增高,VE+Mdivi-1+Cry组细胞凋亡未发生显著改变,但MMP及Bax/Bcl-2和Caspase3蛋白表达降低,而ROS显著性增高,结果表明在抑制线粒体分裂状态下STAT3亚基Y705和S727的磷酸化抑制线粒体凋亡信号,降低GH3细胞凋亡,从而抑制肿瘤细胞增殖,这一过程中STAT3亚基Y705的磷酸化抑制ROS升高,STAT3亚基S727的磷酸化抵抗MMP增高。4.抑制线粒体分裂促进PAPCs肿瘤细胞侵袭和增殖PAPC+Mdivi-1组侵袭性较对照组PAPC增强,PAPC+Mdivi-1+HO-3867和PAPC+Mdivi-1+Cry组侵袭性较PAPC+Mdivi-1明显减弱,结果表明抑制线粒体分裂增强PAPCs肿瘤细胞侵袭性,这一过程可被STAT3抑制剂所阻滞;PAPC+Mdivi-1组增殖能力较对照组PAPC增强,PAPC+Mdivi-1+HO-3867组增殖能力较PAPC+Mdivi-1明显减少,而PAPC+Mdivi-1+Cry组无明显差异,结果表明抑制线粒体分裂促进PAPCs肿瘤细胞增殖,这一过程不因单方面抑制STAT3-Y705磷酸化所抑制,体现STAT3-Y727对PAPCs肿瘤细胞增殖的重要促进作用。结论1.GHPAs侵袭性和增殖与线粒体分裂活动和数量呈负相关性,并与LDHA表达呈正相关。2.抑制线粒体分裂促进GHPAs肿瘤细胞侵袭性,这与STAT3(Y705)的活化增强MMP2/9活性相关。3.抑制线粒体分裂促进GHPAs肿瘤细胞增殖,这与STAT3的活化抑制细胞凋亡相关。4.STAT3的活化与GHPAs肿瘤细胞线粒体数量呈负相关,STAT3(Y705)的活化与肿瘤侵袭性相关,且负性调控ROS;STAT3(S727)的活化负性调控MMP,两者的协同作用抑制线粒体介导的细胞凋亡发生,进而促进肿瘤细胞增殖。