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背景:胃癌是世界范围内高发病率及高致死率的恶性肿瘤之一。目前治疗胃癌的方式主要是手术、化疗及靶向治疗,IA期和IB期肿瘤的5年生存率为60%-80%,但III期肿瘤患者的5年生存率仅为18%-50%,总体生存率较低。胃癌患者存活率低的主要原因是大多数病例初诊时已为疾病晚期,出现肿瘤转移、肿瘤异质性和放化疗抵抗。胃癌早期诊断及有效治疗对于胃癌的预后至关重要,而新的肿瘤标志物和治疗靶点的发现有助于胃癌的早诊、早诊。近年来,多种非编码RNA被证实参与胃癌的发生、发展。其中,环状RNA（circRNA）是一类新型的内源性非编码RNA,由5’和3’端共价结合,并通过反向剪接内含子或外显子形成闭环结构。既往文献显示circRNA可影响多种恶性肿瘤的发生、发展,可作为肿瘤标志物及治疗靶点。Circ RNA主要通过以下三种方式发挥作用:（1）竞争性结合miRNA,抑制其对靶基因的降解,提高靶基因表达水平;（2）与RNA结合蛋白（RBP）相结合,影响蛋白功能或调控下游靶基因水平;（3）部分具有开放阅读框及核糖体进入位点的circRNA,可翻译产生发挥生物学作用的短肽,发挥生物学效应。在本研究中,我们发现并鉴定了一个新的参与胃癌进展的circRNA（hsa＿circ＿0010039）。Hsa＿circ＿0010039是从课题组及GEO数据库胃癌circRNA组织芯片中筛选出来在胃癌及癌旁组织中具有显著差异化表达的circRNA（注:来源于chr1:15844604-15844890,由亲本基因CASP9的10号外显子反向剪切成环构成,大小为286 bp）,故命名为circCASP9。Circ CASP9在胃癌组织中呈现低表达水平且与胃癌肿瘤大小和淋巴结转移相关。体内和体外实验发现circCASP9可抑制胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭。为了探究circCASP9发挥作用的机制,我们通过FISH检测其亚细胞定位,发现circCASP9在胃癌细胞胞质表达。我们猜想circCASP9可能通过吸附miRNA调控m RNA发挥作用。因此,课题组通过生信分析预测并筛选了与circCASP9可能存在结合关系的2个miRNAs（miR-589-5p及miR-4664-3p）以及与miRNA可能具有结合关系的55个m RNAs构建了具有竞争性结合关系的RNA（ceRNA）网络。双荧光素酶及FISH实验验证circCASP9和miR-589-5p具有结合关系。通过文献分析在miR-589-5p的52个靶m RNAs中选出在胃癌中起抑癌作用m RNAs（KANK1、CELF2、NOVA1、SPOP、TOX）,其中KANK1已被报道可调控Wnt/β-catenin/Axin2抑制胃癌细胞增殖、迁移及侵袭。Western blot和q RT-PCR验证KANK1表达可被circCASP9调控且两者表达水平具有一致性,双荧光素酶实验证miR-589-5p和KANK1具有结合关系。随后回复实验证明circCASP9对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的抑制作用以及对KANK1表达的调控作用可被miR-589-5p逆转。通过上述实验,我们证实了circCASP9可通过竞争性吸附miR-589-5p来调节KANK1的表达从而影响胃癌进展。上述研究结果表明circCASP9有成为新的胃癌生物标志物以及治疗靶点的潜能。目的:1.阐明circCASP9对胃癌生物学行为的作用;2.建立新的circRNA-miRNA-m RNA ceRNA网络;3.证实circCASP9通过miR-589-5p/KANK1轴调控胃癌的增殖、迁移、侵袭。方法:1.通过课题组及GEO下载的胃癌circRNA芯片筛选出差异化表达circRNA;q RT-PCR检测circRNA在人胃癌及癌旁组织中,胃癌细胞系及胃正常上皮细胞系中的表达水平;FISH检测circRNA在人胃癌细胞中的定位;最后,分析胃癌组织中circRNA表达水平与胃癌患者临床资料的相关性。2.分别构建过表达和干扰circRNA的胃癌细胞株,通过CCK-8、Ed U、平板克隆、Transwell等体外实验探索circRNA对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响;通过裸鼠皮下成瘤及肝转移模型体内实验探索circRNA对肿瘤生长和转移的作用;免疫组化（IHC）检测circRNA对瘤体增殖指标Ki-67表达水平的影响。3.通过Circ Bank和Star Base在线数据库筛选出circRNA可能结合的下游miRNAs（两个数据库中具有8mer结合位点的miRNAs取交集）;从GEO下载胃癌m RNA数据集并通过R studio筛选出表达下降的m RNA（Downregulated m RNAs）,将Downregulated m RNAs与Star Base、Mi RDB、Target Scan预测的miRNA下游m RNAs取交集获得目的m RNAs,并通过Cytoscape构建circRNA/miRNA/m RNA ceRNA调控网络。FISH和双荧光素酶实验验证circRNA和miRNA的结合关系。在预测的靶m RNAs中通过文献筛选出胃癌中的抑癌m RNAs。Western blot和q RT-PCR检测circRNA对上述抑癌m RNAs的表达水平的调控作用,筛选出可被circRNA调控且表达水平具有一致性的m RNAs。双荧光素酶实验验证miRNA和m RNA的结合关系。回复实验证实miRNA可逆转circRNA对m RNA表达的调控作用以及对胃癌增殖、迁移、侵袭的抑制作用。结果:1.Circ CASP9在人胃癌组织及胃癌细胞系中低表达;组织中circCASP9的表达水平与胃癌肿瘤大小及淋巴结转移数目呈负相关;circCASP9在胃癌细胞胞质中存在定位。2.体外实验显示:circCASP9可以抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭;体内实验显示:circCASP9可抑制裸鼠皮下成瘤及肝脏转移;免疫组化显示:过表达circCASP9后,裸鼠瘤体组织中Ki-67表达下降。3.通过Star Base、Mi RDB、Target Scan、Circ Bank以及GEO数据库筛选出circCASP9的下游靶点miR-589-5p/miR-4664-3p,以及miR-589-5p/miR-4664-3p的下游m RNAs,并通过Cytoscape并构建circRNA/miRNA/m RNA ceRNA调控网络。双荧光素酶实验证实circCASP9仅与miR-589-5p结合,FISH实验证实circCASP9与miR-589-5p在胞质中共定位。文献分析发现miRNA-589-5p的预测靶m RNAs中KANK1、CELF2、NOVA1、SPOP、TOX在胃癌中为抑癌基因。Western blot及q RT-PCR证实上述抑癌基因中KANK1的表达水平受circCASP9调控且与其表达水平具有一致性。双荧光素酶实验证实miR-589-5p与KANK1在胃癌细胞系中存在竞争性结合关系;回复实验证实circCASP9对KANK1表达的调控作用及对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用可被miR-589-5p逆转。结论:Circ CASP9通过竞争性结合miR-589-5p调控下游靶基因KANK1的表达,从而抑制胃癌的增殖、迁移及侵袭能力。