1.研究背景膀胱癌（bladdercancer,BC）是我国泌尿外科临床上最常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤之一。膀胱尿路上皮癌是膀胱癌最为常见的组织学类型。在我国范围内,膀胱癌的发病率位居全身恶性肿瘤的第13位,其中男性膀胱癌患者的发病率位居第七位,女性膀胱癌患者的发病率居位第17位。而在全身恶性肿瘤中,膀胱癌的死亡率位居第13位,其中男性膀胱癌的死亡率位居1 1位,女性膀胱癌的死亡率位居16位。根据肿瘤细胞浸润膀胱肌层的程度可将膀胱癌分为两类:非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（MIBC）。NMIBC是膀胱癌中最为常见的类型,约占膀胱癌患者的70%-75%,其余25%-30%的膀胱癌患者为肌层浸润性膀胱癌,甚至部分膀胱癌患者出现远处转移。NMIBC的主要治疗方式是经尿道膀胱肿瘤切除术,当具有复发和进展高危因素时可术后膀胱内灌注免疫制剂或化疗药物来预防肿瘤复发和进展。经尿道切除肿瘤联合膀胱内灌注卡介苗是NMIBC患者最常见的治疗策略,但是超过50%的患者会复发,10%至30%的NMIBC会发展成MIBC,甚至发生转移。而MIBC恶性程度高,其5年生存率仅为25%。然而,目前膀胱癌的发病机制仍未阐明,需要进一步的基础研究寻找新的靶点,为膀胱癌的治疗提供理论依据。上皮-间质转化（EMT）是一个多步骤过程,其中上皮细胞失去其上皮特性并获得间充质特性,从而使细胞具有迁移和侵袭特性。大量的体外和体内研究表明,EMT是包括膀胱癌在内的各种恶性肿瘤侵袭和转移的初始事件。EMT的启动和发展涉及不同的信号通路和信号串扰,在转录、转录后、翻译和翻译后水平受到调控。转化生长因子-β（TGF-β）通过SMAD途径和非SMAD途径来诱导EMT。其中TGF-β通过由Ⅰ型和Ⅱ型受体组成的四聚体复合物激活Smad2和Smad3,然后与Smad4结合。三聚体Smad复合体易位到细胞核中,并与转录调节因子协同作用,抑制或激活EMT转录因子。研究发现TGF-β通过Smad3/Smad4复合物介导Snail、E-cadherin、Zeb1和Twist等基因的表达。长链非编码RNA（lncRNA）是长度大于200个核苷酸的非编码RNA,是涉及多种生物学过程的新兴调节剂之一。研究发现lncRNA通过多种途径参与广泛的生物学过程,包括增殖、粘附、侵袭、转移、干性、细胞凋亡、基因组不稳定性以及EMT。越来越多的证据表明多种lncRNA通过不同的途径参与膀胱癌的EMT。我们前期研究发现前列腺相关长链非编码RNA-1（PlncRNA-1）在前列腺癌组织及前列腺癌细胞中高表达。PlncRNA-1作为内源性竞争RNA通过miRNA-297-3p和miRNA-34c-5p调控雄激素受体的表达促进前列腺癌的发生发展。此外,PlncRNA-1还可通过TGF-β1调控前列腺癌的增殖和EMT。然而,目前缺乏PlncRNA-1在膀胱癌中的表达水平、生物学功能以及其作用机制的相关研究。在本研究中,我们旨在探讨PlncRNA-1在膀胱癌中的表达水平及其生物学功能,进一步阐释PlncRNA-1发挥调控作用的分子机制,为膀胱癌的临床诊断和预后提供潜在的分子标志物,同时为膀胱癌的靶向治疗及药物开发奠定了实验及理论基础。2.实验方法1)探讨PlncRNA-1的表达水平与膀胱癌患者的年龄、性别、病理分级和分期等临床资料的相关性。2)功能实验研究明确PlncRNA-1调控膀胱癌细胞增殖、EMT等生物学功能。3)探讨PlncRNA-1的表达水平受其基因启动子区域甲基化的调控。4)探讨PlncRNA-1通过调控miRNA-136/Smad3轴促进膀胱癌的进展,为膀胱癌的诊疗提供新策略和新靶点。3.实验方法3.1 PlncRNA-1在膀胱癌组织中的表达及其预测价值1)收集28对膀胱癌组织和癌旁组织,应用液氮冻存或者福尔马林固定组织。同时,收集患者的各种临床信息。2)应用Trizol提取冰冻组织中的总mRNA,逆转录为cDNA后,应用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析PlncRNA-1在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达水平。3)应用R语言进行统计分析。T检验分析PlncRNA-1在各亚组中的差异表达。应用卡方检验分析PlncRNA-1高表达组和低表达组在不同亚组的差异分布。3.2 PlncRNA-1调控膀胱癌细胞的增殖和EMT1)应用Trizol提取多株膀胱癌细胞（5637、T24、J82和RT4）中的总mRNA,逆转录为cDNA后,应用RT-qPCR检测PlncRNA-1在多株膀胱癌细胞中的表达水平。2)设计和合成PlncRNA-1的小干扰RNA（siPlncRNA-1）,应用RT-qPCR验证siPlncRNA-1的干扰效率。3)在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1的表达水平,应用CCK-8实验检测细胞的增殖能力、克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力、划痕实验检测P细胞的迁移能力、Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力。4)在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1的表达水平,应用Western blot检测在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1后EMT标志物蛋白的表差异达。5)在体内检测敲低PlncRNA-1对膀胱癌细胞增殖的调控。应用裸鼠进行皮下植瘤,称量种植瘤的体积和重量,绘制生长曲线,同时利用免疫组织化学技术（IHC）检测种植瘤中细胞增殖相关蛋白Ki-67的表达水平。3.3 PlncRNA-1启动子区的低甲基化可促进其表达1)生物信息学分析:应用Wanderer和Mexpress分析PlncRNA-1基因启动子区域的甲基化修饰水平及其甲基化水平与表达水平之间的相关性。2)应用亚硫酸氢盐扩增子测序（BSAS）探索PlncRNA-1基因启动子区域的甲基化修饰位点。3)应用不同浓度的5-氮杂-2’-脱氧胞苷（AZA）处理膀胱癌细胞,提取细胞DNA,应用亚硫酸氢盐转化试剂盒将胞嘧啶转化为尿嘧啶,然后进行一代测序,检测PlncRNA-1的基因启动子区域131位点的甲基化水平。同时提取细胞总mRNA,逆转录为cDNA后,应用RT-qPCR检测AZA对PlncRNA-1表达水平的调控作用。4)随机选取6对膀胱癌组织,提取组织DNA,应用亚硫酸氢盐转化试剂盒将胞嘧啶转化为尿嘧啶,应用重亚硫酸盐测序法（BSP）联合一代测序,检测在膀胱癌组织中PlncRNA-1基因启动子区域131位点的甲基化水平。同时提取上述选取6对膀胱癌组织的总mRNA,逆转录为cDNA后,应用RT-qPCR检测在膀胱癌组织中PlncRNA-1的表达水平。3.4 PlncRNA-1通过调控miRNA-136/smad3轴促进膀脱癌的进展1)应用Trizol提取28对冰冻组织中的总mRNA,逆转录为cDNA后,应用RT-qPCR分析Smad3 mRNA在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达水平。应用Pearson相关系数检测Smad3 mRNA和PlncRNA-1在膀胱癌组织中表达水平的相关性。同时应用IHC分析Smad3蛋白在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达水平。2)应用FISH对PlncRNA-1在膀胱癌细胞中的亚细胞结构进行定位。3)在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1的表达后,应用RT-qPCR检测Smad3 mRNA的表达水平,同时应用Western blot检测Smad3蛋白和磷酸化Smad3蛋白的表达水平。同时应用miRNA-seq检测敲低PlncRNA-1的表达后miRNA的差异改变,并对miRNA的预测靶标进行GO富集分析和KEGG富集分析。4)应用Trizol提取28对冰冻组织中的miRNA,逆转录为cDNA后,应用RT-qPCR分析miRNA-136在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达水平。5)在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1的表达后,应用RT-qPCR检测miRNA-136的表达水平。6)在膀胱癌细胞中敲低或过表达miRNA-136,应用RT-qPCR验证敲低或过表达的效率,应用RT-qPCR检测PlncRNA-1和Smad3 mRNA的表达水平,同时应用Western blot检测Smad3蛋白和磷酸化Smad3蛋白的表达水平。7)构建PlncRNA-1野生型和突变型的质粒,在293T细胞中双转染质粒和miRNA-136模拟物,双荧光素酶实验验证PlncRNA-1可作为miRNA-136的竞争性内源 RNA。8)挽救实验:在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1后,再敲低miRNA-136,应用Western blot检测Smad3蛋白、磷酸化Smad3蛋白和EMT标志物蛋白的表达水平。4.实验结果4.1 PlncRNA-1在膀胱癌组织中的表达及其预测价值1)与配对的癌旁组织相比,发现PlncRNA-1在71.43%（20/28）的膀胱癌组织中明显高表达。2)亚组分析显示,PlncRNA-1在≥65岁组（p=0.048）、单发肿瘤组（p=0.049）、MIBC组（p=0.0075）和T3-T4分期组（p=0.019）中高表达。3)在膀胱癌组织中,根据PlncRNA-1表达水平的中位数,将膀胱癌分为PlncRNA-1高表达组和低表达组。在PlncRNA-1低表达组中,T1-T2分期占100%（14/14）,而MIBC分期占42.86%（6/14）。在PlncRNA-1 高表达组中,T1-T2分期占57.14%（8/14）,而MIBC分期占85.71%（12/14）。根据PlncRNA-1的表达水平,可以预测膀胱癌患者的肿瘤浸润程度和T期。4.2 PlncRNA-1调控膀胱癌细胞的增殖和EMT1)在不同的膀胱癌细胞系中PlncRNA-1的表达水平存在差异,在5637细胞中表达水平最高,在T24细胞中表达水平最低。2)设计和合成PlncRNA-1的干扰RNA。与对照组相比,siPlncRNA-1可有效降低T24和5637细胞中PlncRNA-1的表达水平。3)PlncRNA-1可抑制膀胱癌细胞的增殖和克隆形成能力:CCK-8实验证明在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1可明显抑制细胞的增殖能力。克隆形成实验进一步表明,敲低PlncRNA-1可明显抑制细胞克隆形成能力。4)PlncRNA-1可抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力:应用划痕实验证明敲低PlncRNA-1可明显抑制膀胱癌细胞的迁移能力。Transwell实验证明敲低PlncRNA-1可明显抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力。5)PlncRNA-1可调控EMT相关蛋白的表达水平:与对照组相比,敲低PlncRNA-1可明显下调N-cadherin蛋白和Vimentin蛋白的表达,上调E-cadherin蛋白的表达。6)体内研究表明敲低PlncRNA-1可明显抑制肿瘤的生长,降低肿瘤的重量,减小肿瘤的体积。免疫组织化学染色分析表明敲低PlncRNA-1可明显降低Ki-67蛋白的表达。4.3 PlncRNA-1启动子区的低甲基化可促进其表达1)应用Wanderer和Mexpress在线工具发现,在膀胱癌组织中PlncRNA-1基因启动子区域的甲基化水平降低,且PlncRNA-1启动子区域的甲基化水平与PlncRNA-1的表达水平呈负相关。2)在膀胱癌T24和5637中,应用BSAS分析PlncRNA-1基因的转录起始位点（TSS,上游2000bp和下游1000bp）的甲基化水平。研究发现PlncRNA-1启动子的131位（位于21号染色体的36157603位）甲基化水平较高,且两株细胞的甲基化水平存在明显差异。3)BSP联合一代测序显示不同浓度的AZA处理膀胱癌细胞后可明显抑制PlncRNA-1启动子区域的甲基化。同时对BSP扩增的产物随机挑取10个单克隆进行一代测序,发现随着AZA浓度的升高,甲基化的单克隆数目越少。因此,AZA可以有效抑制PlncRNA-1启动子的甲基化水平。4)应用不同的AZA浓度处理膀胱癌细胞后,研究发现随着AZA浓度的升高,PlncRNA-1的表达水平也逐渐升高。5)随机选取6对膀胱癌组织和癌旁组织进行BSP和一代测序,发现在膀胱癌组织中PlncRNA-1启动子的131位甲基化水平明显低于癌旁组织。6)应用上述选取6对膀胱癌组织和癌旁组织进行提取总mRNA,进行RT-qPCR。发现在膀胱癌组织中PlncRNA-1的表达水平明显高于癌旁组织。4.4 PlncRNA-1通过调控miRNA-136/Smad3轴促进膀胱癌的进展1)在膀胱癌组织中Smad3mRNA和蛋白的表达水平明显高于癌旁组织。相关性分析表明,在膀胱癌组织中PlncRNA-1和Smad3 mRNA的表达水平存在强正相关（R=0.82,p=9.7e-08）。2)应用FISH发现PlncRNA-1主要分布在膀胱癌细胞的细胞核中,部分分布在细胞质中。3)在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1可明显下调Smad3 mRNA、Smad3蛋白和磷酸化Smad3蛋白的表达水平。4)在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1后进行miRNA测序,发现有36个miRNA差异表达,其中has-miRNA-136-5p是差异倍数最大的miRNA。对miRNA的靶基因进行GO富集分析和KEGG富集分析发现,miRNA靶基因调节的生物学过程包括:转录,经典Wnt信号传导和细胞内信号转导。miRNA靶基因主要位于细胞核和细胞质。miRNA靶基因的主要分子功能包括蛋白质和DNA结合以及转录活性。miRNA靶基因主要参与的通路包括多个癌症途径、粘着斑、肌动蛋白细胞骨架的调节、mTOR信号传导途径、Wnt信号传导途径和转录活性。5)miRNA-136在膀胱癌组织中的表达明显低于癌旁组织相比（p=0.0078）。6)在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1可明显上调miRNA-136的表达。7)在膀胱癌细胞中敲低或过表达miRNA-136,RT-qPCR验证发现敲低或过表达miRNA-136的效果明显。同时发现敲低或过表达miRNA-136的表达可明显调控PlncRNA-1 mRNA、Smad3mRNA、Smad3蛋白和磷酸化Smad3蛋白的表达水平。8)双荧光素酶报告基因检测发现miRNA-136可以与PlncRNA-1直接结合。9)挽救实验:在膀胱癌细胞中敲低PlncRNA-1后再次敲低miRNA-136。挽救实验发现敲低miRNA-136可部分恢复PlncRNA-1下调诱导的Smad3蛋白、磷酸化Smad3蛋白和EMT标志蛋白表达的变化。5.实验结论1)PlncRNA-1作为癌基因,在膀胱癌组织中过表达,其表达水平与肿瘤浸润、T分期、年龄和肿瘤数目相关。PlncRNA-1的表达水平可以在一定程度上用作膀胱癌患者肿瘤侵袭程度和T分期的预测指标。2)功能研究证实PlncRNA-1可调控膀胱癌细胞的增殖和EMT。3)在膀胱癌组织中PlncRNA-1启动子的131位点（21号染色体上的36157603）存在低甲基化修饰,而PlncRNA-1启动子的低甲基化可促进其自身表达的上调。4)机制研究发现PlncRNA-1通过调控miRNA-136/Smad3轴促进膀胱癌的进展,为膀胱癌的诊疗提供新策略和新靶点。