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研究背景支气管哮喘被定义为一种以气道重塑、气道粘液高分泌、气道高反应性为主要生理病理特征的气道慢性炎症性疾病。哮喘通常表现为可逆性气流受限,疾病早期气流受限程度相对较轻多可自行缓解或经抗哮喘药物治疗后缓解。但随着疾病的进展哮喘的气流受限逐渐转变为不可逆性,气道重塑在此过程中发挥了重要作用。EMT即上皮间充质转化,是指上皮细胞失去上皮细胞样特征逐渐向间充质细胞转化的过程。EMT主要表现为间充质细胞标志物N-cadherin、Fibronection、Vimentin表达增多以及上皮细胞标志物E-cadherin表达减少。既往研究表明EMT在器官纤维化及哮喘气道重塑中均具有重要作用。因此探索EMT过程的相关调控分子进而明确哮喘气道重塑机制在延缓哮喘进展以及发现新的哮喘治疗靶点来说都是至关重要的。TL1A是具有促炎作用的肿瘤坏死因子超家族的一员。TL1A选择性地与DR3结合发挥作用。TL1A/DR3轴与多种自身免疫症疾病密切相关。既往研究发现TL1A具有促炎、调节免疫及促纤维化作用。并且Clarke等人研究发现抗TL1A抗体可减轻哮喘小鼠模型的肺纤维化及肺部炎症。IL-10被认为是一种抗炎细胞因子。近几年多项研究发现IL-10对炎症性肠病、肺间质纤维化、肾脏纤维化、心肌纤维化发生均具有重要作用。Kurosaki等人发现IL-10可阻止并逆转博莱霉素诱导的肺纤维化模型小鼠的肺纤维化。TNF-α同样是一种促炎细胞因子,既往研究发现哮喘患者气道内TNF-α水平升高。Catal等人发现抗TNF-α治疗可显著减轻急性哮喘模型小鼠的肺部炎症细胞浸润。值得关注的是TNF-α与组织器官纤维化及重构的发生密切相关。Zhou等人研究发现TNF-α可以促进人近端肾小管上皮细胞的上皮间充质转化过程。近期有研究发现重症哮喘患者经抗TNF-α抗体治疗后肺功能较前显著改善。基于上述证据,我们认为TL1A/DR3轴、IL-10、TNF-α可能对哮喘气道EMT及气道重塑发生具有重要作用。本文拟通过构建哮喘小鼠模型以及进行Beas-2B细胞体外实验,明确IL-10、TNF-α、TL1A/DR3轴在哮喘模型小鼠肺内表达情况,以及IL-10、TNF-α对TL1A/DR3轴、气道重塑、气道EMT的影响。进而为新的哮喘治疗靶点的发现及哮喘气道重塑的早期干预提供新的思考方向及理论依据。研究目的探究TL1A/DR3轴、TNF-α、IL-10及气道重塑和气道EMT指标在哮喘小鼠肺内表达情况。在哮喘动物模型及人支气管上皮细胞中探索IL-10、TNF-α对TL1A/DR3轴、气道EMT及气道重塑的影响。以期发现哮喘气道EMT及气道重塑的机制。研究方法1.构建哮喘小鼠模型:选用C57BL/6雌鼠（6-8周龄）造模。第一次造模,共分OVA组和Control组2组,两组中均随机分6只小鼠。第二次造模,共分4组,分别为:IL-10干预组、Control组、IL-10+OVA组、OVA组。造模具体方法见下文实验方法部分。2.小鼠肺组织切片HE、Masson染色,评估模型小鼠肺组织病理改变和胶原沉积情况。3.小鼠肺组织切片F4/80、IL-10免疫组织化学染色评估肺内巨噬细胞浸润情况及IL-10表达情况。4.肺组织切片α-SMA、Collagen Ⅰ免疫荧光染色,评估α-SMA、Collagen I在小鼠气道组织内的分布及表达量。5.ELISA法检测小鼠肺泡灌洗液中IL-10浓度。6.Western Blot法检测小鼠肺内IL-10、TNF-α、（m+s）TL1A、DR3、Vimentin、N-cadherin表达水平。7.体外培养Beas-2B细胞共分为4组:空白对照组、TNF-α组、TNF-α+50ng/ml IL-10组、TNF-α+300ng/ml IL-10组（TNF-α浓度均为50ng/ml）。加细胞刺激方法详见实验方法部分。体外培养48h后收集细胞蛋白,Western Blot法检测各组Beas-2B细胞（m+s）TL1A、DR3、Collagen Ⅰ、Fibronectin、Vimentin、N-cadherin 蛋白表达情况。研究结果1.HE染色示OVA组小鼠气道内黏液分泌、气道壁厚度、气道周围炎症细胞浸润均教Control组显著增多。2.Masson染色示OVA组小鼠气道周围胶原沉积量显著高于Control组。3.OVA组小鼠肺组织F4/80免疫组化染色阳性染色部分较Control组显著增加。小鼠BALF内IL-10浓度ELISA检测结果、肺组织IL-10蛋白Western Blot检测结果及肺组织IL-10免疫组化染色结果均提示OVA组小鼠肺内IL-10水平较Control组显著减低。4.OVA组小鼠肺组织α-SMA及Collagen Ⅰ免疫荧光染色示OVA组α-SMA及Collagen I含量显著高于Control组。IL-10+OVA组小鼠肺组织α-SMA及Collagen Ⅰ荧光强度较OVA组显著减低。5.蛋白印迹实验结果示OVA组小鼠肺组织（m+s）TL1A、DR3、TNF-α、Vimentin、N-cadherin蛋白水平较Control组显著增高。IL-10干预OVA组小鼠肺内（m+s）TL 1A、DR3、Vimentin、N-cadherin蛋白表达较OVA组显著减低。6.蛋白印迹实验结果示TNF-α刺激后Beas-2B细胞（m+s）TL1A、DR3、Vimentin、N-cadherin、Fibronectin、Collagen Ⅰ蛋白表达量显著增加。高、低浓度IL-10干预均可使 TNF-α诱导的 Beas-2B 细胞（m+s）TL1A、DR3、Vimentin、N-cadherin、Fibronectin、Collagen I蛋白表达减低。研究结论1.TNF-α可诱导Beas-2B细胞TL1A/DR3轴及间充质细胞标志物表达。2.IL-10可抑制TNF-α诱导的Beas-2B细胞TL1A/DR3轴及间充质细胞标志物表达。3.哮喘模型小鼠肺组织中TNF-α水平升高,IL-10水平减低,TL1A/DR3轴表达增多。4.IL-10可抑制哮喘小鼠肺组织中TL1A/DR3轴表达并减轻气道EMT及气道重塑。