研究背景寨卡病毒病是由寨卡病毒(Zika Virus,ZIKV)感染引起的一种急性虫媒传染病。2015年以来,寨卡病毒病相继在南美、北美、欧洲、亚洲等多个国家或地区爆发,可引起格林-巴利综合征(Guillain-Barrésyndrome,GBS)和新生儿小头畸形等严重并发症,引起全球公共卫生领域的广泛关注。ZIKV属于黄病毒科黄病毒属,主要通过伊蚊叮咬传播,目前已有研究报道发现可通过血液传播、性传播及母婴途径传播。ZIKV首次分离于寨卡森林一只恒河猴体内,1960年报道人类感染病例,但由于其发病率低,临床致病相对缓和,一直未得到关注。2007年,ZIKV首次在太平洋的亚浦岛出现大规模爆发,症状较轻;第二次大规模于2013-2014年发生在法属波利尼西亚群岛;2015-2016年,疫情开始在中、南美洲爆发流行。由于寨卡病毒感染可引发胎儿小头畸形以及对成人的神经损伤,WHO将疫情上升为“已构成国际关注的突发公共卫生事件”。我国于2016年发现多例输入性病例。同年度,ZIKV在东南亚、印度等地也逐渐大范围流行。ZIKV呈球形颗粒状,整体基因组为单股正链RNA,长度11kb左右,由单一读码框顺序编码3种结构蛋白(C、prM/M和E)和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。结构蛋白形成病毒主体结构;非结构蛋白主要功能在于病毒复制过程中的协助,包括为病毒组装、入侵、成熟和释放提供辅助作用。ZIKV的E蛋白具有病毒特异性抗原表位,在病毒入侵宿主过程中起到主要作用,目前大部分疫苗和药物研究是以E蛋白为主要靶点。NS1蛋白作为诊断的靶标有重要的研究价值。近些年研究者们以NS1为主要研究靶标建立了DENV的血清学诊断方法和产品。由于ZIKV与DENV在氨基酸序列上的同源性以及空间结构上的相似性,在登革病毒流行地域,如何进行实验室准确诊断是值得关注的问题。结构上的相似性和由此带来的血清交叉反应为ZIKV血清学的特异性检测带来了极大的挑战。研究者们近期在ZIKV在与DENV的鉴别诊断、提高检测特异性方面做了多种尝试。有研究通过对E蛋白的结构改造、定位NS1特异性抗原靶点反应等方式尝试提高ZIKV血清学检测方法的特异性,但仍存在提升空间。核酸鉴别检测方法具有灵敏度高,特异性好的优点,但对于恢复期或既往感染的病例进行研究时,核酸检测有假阴性的风险,急需建立IgG等血清学检测方法。另一方面,核酸检测需要严格的样本处理和实验操作程序,检测周期需要3-5小时,不能满足现场快速筛查诊断的需求,所以对于输入性病例快速筛查诊断产品的需求也极为迫切。研究目的了解输入性寨卡病毒感染宿主NS1抗体反应特征,分离人源性单克隆抗体,分析总结NS1抗体反应在血清多克隆抗体和单克隆抗体水平上的特异性和结合特点,为寨卡病毒的血清学诊断提供理论支持。同时探讨单克隆抗体在早期诊断中的应用,为寨卡病毒感染的早期诊断提供可靠的工具。研究内容和方法1、寨卡病毒NS1蛋白的表达和捕获ELISA方法的建立(1)扩增样本来源核酸获得寨卡病毒NS1全长片段,并克隆到改造过的载体上构建表达载体;(2)通过转染哺乳系293T细胞表达C端带有标签的NS1蛋白;(3)用抗标签的抗体捕获转染上清中的NS1蛋白,建立捕获ELISA方法。2、寨卡病毒血清NS1抗体反应特征(1)以建立的捕获ELISA方法检测寨卡病毒感染者系列时间点血清样本,观测血清NS1的反应动态变化特点;(2)以建立的捕获ELISA方法检测登革病毒1型感染者血清样本,观测血清NS1的交叉变化特点。3、寨卡病毒NS1单克隆抗体特异性分析(1)分离寨卡病毒感染者外周血单核细胞,流式分选记忆B细胞,应用单细胞PCR技术克隆和表达抗体重链和轻链可变区,通过共转染293T细胞表达抗体,筛选出单克隆抗体;(2)表达的单克隆抗体进行结合活性分析。4、NS1特异性单克隆抗体在ZIKV早期诊断中的应用将特异性单克隆抗体应用到NS1抗原早期筛查胶体金试纸条制备中,并对血清、尿液样本进行测试获得初步应用评价。研究结果1、NS1蛋白的表达和捕获ELISA方法的建立(1)扩增获得NS1全长基因,并构建了C端带标签的寨卡病毒和登革病毒1-4型NS1表达载体;序列分析寨卡病毒与登革病毒NS1氨基酸序列相似度达到54-55%;(2)采用哺乳系细胞293T表达获得带有标签的寨卡病毒和登革病毒1-4型NS1蛋白,经Westen-Blot鉴定大小约为55KDa;(3)用抗标签抗体捕获NS1蛋白,建立捕获ELISA方法,对阳性血清及稀释梯度呈现梯度反应强度;说明捕获ELISA可作为血清NS1抗体反应的方法。2、ZIKA感染者血清NS1抗体反应特征(1)ZIKV感染者血清NS1抗体反应动态变化:我们以来自两例寨卡感染者的系列时间点血清样本,以捕获ELISA方法分析NS1抗体反应的动态变化情况,发现寨卡病毒感染者血清NS1结合反应具有高度的特异性,相对应的,血清与寨卡病毒E蛋白、登革病毒1-4型E蛋白均具有明显的交叉反应特点。另外血清E蛋白抗体反应进展迅速,在发病第7天即出现并呈现高结合效价,第15天达到峰值后回落;而NS1抗体反应出现较为缓和,第15天开始观测到结合反应,第166天才缓慢至结合峰值后开始回落;(2)DENV感染者血清NS1抗体交叉反应分析:选取108例登革病毒1型感染者血清进一步对NS1抗体反应特性进行研究,其中包括初次感染者35例,二次感染者20例,未知初次或二次者53例,我们发现绝大多数DENV1感染者血清样本(106/108)不存在与寨卡病毒NS1的结合反应;相对应的,登革病毒2-4型NS1与DENV1型感染者血清存在广泛交叉反应。3、寨卡感染者获得的NS1单抗特异性分析(1)通过单细胞抗体技术,共筛选到5株单克隆抗体,分别命名为ZKns3G2、ZKns2E11、ZKns14G5、ZKns4B8、ZKns4F10;(2)表达抗体经纯化定值,结合活性实验结果表明其中4株单克隆抗体为NS1高特异性抗体,结合活性EC50可达9.8~277.4ng/m L,不存在与DENV1-4型NS1结合活性,仅有1株单克隆抗体ZKns4F10与登革病毒2型和4型存在交叉反应,EC50为116.1～351.4ng/m L,这可能与ZIKV和DENV在NS1蛋白上的相似性有关。4、NS1特异性单克隆抗体在ZIKV早期诊断中的应用单克隆抗体应用于胶体金试纸条制备中,对重组NS1蛋白检测下限达到10ng/m L,能成功检测寨卡病毒感染者急性期样本中的NS1蛋白。研究结论寨卡病毒感染者血清NS1抗体反应与E蛋白抗体反应相比具有高度特异性和延迟性的特点。单克隆抗体水平上分析同样显示NS1抗体反应具有高度特异性的特点。NS1抗体反应特异性和延迟性的特点为ZIKV的血清学诊断提供了理论支持。人源性单克隆抗体可应用于寨卡病毒筛查胶体金试纸条的研制开发中,适用于寨卡病毒感染的早期诊断。