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亚急性瘤胃酸中毒(Subacute ruminal acidosis,SARA)是一种易发生于高产奶牛牛群的代谢性疾病。其主要原因是生产过程中过度饲喂精饲料,瘤胃内碳水化合物大量发酵,致使瘤胃内短链脂肪酸(short-chain fatty acid,SCFA)蓄积。SCFA在瘤胃内的浓度过高,会使瘤胃pH降低,当pH低于5.6且每天持续时间在3 h以上即可认定为SARA。瘤胃长时间处于酸性环境,革兰氏阴性菌溶解破裂,释放出其菌壁成分脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)。同时,一些瘤胃细菌在酸性环境下使组氨酸脱羧生成组胺。LPS和组胺都可引起瘤胃炎症发生,损伤瘤胃上皮组织。当上皮损伤达到一定程度时,LPS和组胺可以易位进入血液,引起其它部位炎症如蹄叶炎和肝脓肿等,有时甚至是全身性炎症反应。而SCFA在瘤胃内蓄积的原因主要是生成增多和/或吸收障碍,但目前还不清楚瘤胃SCFA吸收障碍的原因和机制。新近研究发现溶质载体家族SLC22A(solute carrier family)转运蛋白,它的亚族有机阴离子转运载体OATs(Organic anion transporters)是丙酸和丁酸进入肝细胞的摄取通路,具有转运SCFA的作用。而另一亚族新型有机阳离子转运载体OCTNs(organic cation/carnitine transporter),转运体内多种内源性和外源性阳离子和两性离子,如肉毒碱、胆碱和麦角硫因等物质,它们都具有抗炎抗氧化作用。但是SLC22A转运蛋白在反刍动物瘤胃上皮的相关研究却鲜有报道。所以探究奶牛SARA时瘤胃炎症的发生机制和瘤胃上皮SLC22A蛋白表达变化,阐明SARA瘤胃代谢异常、上皮炎性损伤和SCFA吸收障碍之间的内在联系,对于解释奶牛SARA的发生机理和防治具有重要的意义。本实验首先检测了SARA奶牛瘤胃液中SCFA各组分(主要包括乙酸、丙酸和丁酸)、LPS、组胺和乳酸等浓度,发现均显著高于健康奶牛。而后检测了SARA奶牛血液中组胺、LPS、急性期反应蛋白,包括内毒素结合蛋白(Lipopolysaccharide binding protein,LBP)、触珠蛋白(haptoglobin,HP)和血清淀粉样蛋白A(Serum amyloid A,SAA),细胞因子包括肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白细胞介素(interleukin,IL)-6和白细胞介素(interleukin,IL)-1β等指标,各项指标水平均明显高于健康奶牛,提示SARA奶牛出现严重的炎症反应。通过Western blot和荧光定量PCR检测了SARA奶牛瘤胃上皮炎症信号通路核内转录因子(nuclear factor-kappaB,NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)关键蛋白和细胞因子表达变化。实验结果表明SARA奶牛的瘤胃上皮细胞NF-κB和MAPK炎症通路均被激活,通路关键蛋白IκBα、NF-κB p65、JNK和ERK1/2磷酸化水平均明显升高,且细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA和蛋白表达均明显高于健康奶牛,进一步证明了SARA奶牛瘤胃炎症的发生。体外实验通过分离培养奶牛瘤胃上皮细胞,通过不同时间点(0、1、3、6、9、18 h)确定最佳刺激时间后,添加不同浓度LPS(0、1、5、10μg/ml)和组胺(0、20、40、60μM)模拟体内健康和SARA的状态,然后通过Western blot检测MAPK和NF-κB炎症通路关键蛋白磷酸化水平,免疫荧光观察p65入核情况,荧光定量PCR和ELISA检测细胞因子的表达变化。实验结果表明,LPS和组胺在刺激瘤胃上皮细胞6-9h时,炎症信号通路NF-κB和MAPK关键蛋白磷酸化水平明显升高,且呈现剂量依赖性升高,NF-κB p65入核明显增多,诱导炎性因子靶基因转录。细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量和mRNA表达量显著提升,诱导炎症发生。另一方面,体内实验采用Western blot和免疫组化方法检测了SLC22A家族关键成员(OAT2、OAT7、OCTN1和OCTN2)在瘤胃上皮的表达和分布,结果表明它们在奶牛瘤胃四个囊腔的上皮中均有表达。SARA奶牛瘤胃上皮转运蛋白OAT2和OAT7表达受到了抑制,OCTN2表达略有下降。说明SARA奶牛瘤胃中SCFA的吸收转运受到影响,肉毒碱和麦角硫因等有益物质的转运也发生障碍。体外实验通过不同浓度的SCFA各组分、LPS、组胺和低pH环境模拟SARA时瘤胃内各因素变化对SLC22A转运蛋白的影响。结果表明,正常生理浓度的乙酸、丙酸和丁酸刺激,对转运蛋白OAT2、OAT7、OCTN1和OCTN2的表达均有促进作用,而高浓度SCFA和低pH环境对蛋白表达抑制;LPS和组胺作用抑制OAT2和OAT7的表达,而组胺促进OCTN1和OCTN2的蛋白表达。综上所述,SARA奶牛瘤胃内高浓度的LPS和组胺,可以激活MAPK和NF-κB炎症信号通路,刺激下游靶基因转录释放促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6,进一步诱导炎症的发生。而瘤胃上皮转运蛋白OAT2、OAT7和OCTN2表达受到抑制,加剧SARA。