合成香叶醇的大肠杆菌工程菌株的构建与应用

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传统的香叶醇萃取以及化学合成方式有着一定的局限,难以满足市场上对天然香叶醇的需求,因此,绿色环保的生物合成方式应运而生。随着合成生物学技术的进步,以廉价、可再生的微生物发酵生产香叶醇成为发展趋势。利用大肠杆菌生物法合成具有催化效率高、产物专一性强、反应条件温和、发酵时间短、绿色经济等优势。本研究通过利用大肠杆菌为底盘细胞,根据酵母菌代谢通路以及涉及的基因,设计质粒载体,最终把通路上的九个相关基因分别连在三个目标载体上,转化到BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中,探究其发酵产生香叶醇的能力,经过不断优化,探索出一条低碳、高效、安全生产工业化香料香叶醇的途径,为工业生产奠定理论研究基础。本文的主要研究结果分为以下几个方面:1、香叶醇合成通路的设计。合成香叶醇的大肠杆菌细胞工厂需要的基因(共表达乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10、羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因ERG13、羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因tHMG1、甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、脱羧酶基因ERG19、异戊烯基焦磷酸异构酶基因IdI1、香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2、和香叶醇合成酶基因GES共9个基因)的密码子优化以及合成,每个基因具有独立的启动子和终止子序列。2、重组质粒的构建。将乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10、羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因ERG13和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因tHMG1连接到质粒pCOLADuet-1,得到重组质粒1;将甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8和脱羧酶基因ERG19连接到质粒pTrcHis2B,得到重组质粒2;将异戊烯基焦磷酸异构酶基因IdI1、香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2和香叶醇合成酶基因GES连接到质粒pACYCDuet-1,得到重组质粒3。3、将3个重组质粒导入E.coli BL21(DE3)中,得到大肠杆菌工程菌株。以葡萄糖为原料在有氧条件诱导下生物合成香叶醇。4、摇瓶发酵培养基和发酵条件的优化。利用单因素实验优化发酵条件:研究发酵温度、诱导温度、转速、诱导剂浓度以及不同碳氮源等对香叶醇产量的影响。本实验24 h香叶醇的产量是58 mg/L,经过培养基以及培养条件优化后,产量可以达到150 mg/L,可以预计,本文所用到的大肠杆菌工程菌株SZL在以后的生产方面必将有着重要的作用。而且利用大肠杆菌表达菌株SZL生产香叶醇具有质量可靠、产品经济、绿色生产等优点,应用前景非常好。本研究为香叶醇的大规模工业生产奠定了基础,具有重要的经济价值和社会效益。
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