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第一部分肿瘤相关巨噬细胞的诱导建立及表型鉴定目的：体外诱导建立人肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，并分析其生物学表型特征。方法：一般认为，普通巨噬细胞为M1型巨噬细胞，TAM为M2型巨噬细胞。本实验首先采用佛波酯（PMA）刺激人单核细胞株THP-1细胞贴壁分化为巨噬细胞（M0型），再通过人巨噬细胞集落刺激因子（MCSF）或LPS/IFN-γ分别刺激巨噬细胞分化成为TAM或M1型巨噬细胞，采用免疫磁珠法体外分离人乳腺癌组织中的TAM。采用流式细胞仪分析不同巨噬细胞表面分子CD163的表达水平；western blot实验检测各类型巨噬细胞内精氨酸酶(Arginase)-1的表达，精氨酸酶活性试验分析其活性；Real-time PCR分析各组细胞IL-10、IL-12及IL-23等细胞因子mRNA的表达，ELISA实验检测各组细胞IL-10及IL-12/23蛋白水平的表达。结果：相比于单独PMA诱导的M0型及LPS/IFN-γ后续诱导的M1型巨噬细胞，MCSF诱导的巨噬细胞CD163表达量明显增加，arginase-1蛋白水平及活性显著增高，Real-time PCR实验显示其IL-10mRNA表达明显增高，IL-12及IL-23mRNA表达明显降低，后续ELISA实验也证实其IL-10蛋白表达显著增高，IL-12/23蛋白表达显著降低，以上表型特征与体外分离的乳腺癌组织TAM一致。结论：成功诱导建立TAM，其表型特征为M2型巨噬细胞，表现为CD163、arginase-1、IL-10高表达、IL-12及IL-23低表达。第二部分肿瘤相关巨噬细胞对人乳腺癌细胞耐药的影响及初步机制研究目的：探讨肿瘤相关巨噬细胞（TAM）对人乳腺癌细胞多药耐药的影响，并初步分析其潜在分子机制。方法：首先通过CCK-8法分析比较单独培养或与TAM共培养后的人乳腺癌MDA-MB-231及MCF-7细胞对阿霉素(ADM)、顺铂及紫杉醇等不同化疗药物的敏感性，并计算相对耐药指数(RI);流式细胞仪检测ADM对不同培养条件下人乳腺癌细胞的杀伤作用，caspase-3活性试剂盒检测各组细胞caspase-3活性；分光光度计分析各处理条件下乳腺癌细胞内ADM浓度，流式细胞仪分析细胞外排罗丹明能力；Real-time PCR及western blot法检测不同处理条件下人乳腺癌细胞内P-gp、MRP、LRP及BCRP等耐药蛋白的表达水平；western blot检测各处理条件下人乳腺癌细胞Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bad和Bid等凋亡相关蛋白的表达水平。结果：与单独培养的乳腺癌细胞相比，与TAM共培养后的乳腺癌细胞对ADM、紫杉醇及顺铂等药物的敏感性降低，耐药指数增加；共培养后的乳腺癌细胞接受ADM处理后，凋亡明显减少，细胞caspase-3活性明显降低。分光光度计及流式细胞仪分别分析显示，相比于单独培养的乳腺癌细胞，共培养后的乳腺癌细胞内ADM浓度明显下降，外排罗丹明能力也显著增加。Real-time PCR及western blot实验显示，TAM共培养后的乳腺癌细胞中P-gp mRNA及蛋白表达明显增高，而其他耐药因子如MRP、LRP和BCRP等的mRNA及蛋白表达无显著改变。加入P-gp抑制剂C-4抑制P-gp功能，可降低TAM共培养后的乳腺癌细胞外排罗丹明的能力，增加细胞对ADM的敏感性，部分逆转TAM介导的细胞耐药。进一步的研究发现，TAM还可促进乳腺癌细胞抗凋亡因子Bcl-2的表达，抑制促凋亡因子Bax的表达。结论：TAM可引起人乳腺癌细胞耐药，其机制与TAM促进乳腺癌细胞过表达P-gp耐药蛋白及抗凋亡因子Bcl-2，抑制细胞促凋亡因子Bax的表达有关。第三部分COX-2/PGE2/Akt信号传导通路在肿瘤相关巨噬细胞介导人乳腺癌细胞耐药中的作用及分子机制研究目的：深入探讨和分析相关信号通路在肿瘤相关巨噬细胞（TAM）介导人乳腺癌细胞耐药过程中的作用及分子机制。方法：Western-blot分析PI3K/Akt、NF-κB及GSK-3β/β-catenin等信号通路在不同条件下人乳腺癌细胞中的激活情况；细胞免疫荧光分析p-Akt、p-GSK-3β及β-catenin在人乳腺癌细胞中的表达及分布。使用PI3K/Akt通路抑制剂wortmannin抑制PI3K/Akt通路，或使用腺病毒载体系统敲除细胞β-catenin表达，流式细胞仪分析不同处理条件下细胞外排罗丹明能力以及ADM刺激下细胞凋亡情况，western-blot检测干预这两条信号通路对细胞P-gp、Bcl-2及Bax蛋白表达的影响。ELISA及EIA法检测细胞上清中TGF-β、TNF-α、IL-1β及PGE2的表达；使用PGE2信号传导阻断剂AH6809及AH23848B阻断细胞PGE2信号的传导，观察和检测乳腺癌细胞外排罗丹明能力、ADM刺激下细胞凋亡情况、Akt和GSK-3β/β-catenin通路激活情况、以及P-gp、Bcl-2及Bax的表达水平。Western-blot检测人乳腺癌细胞及不同类型巨噬细胞中COX-1及COX-2的表达；腺病毒载体系统敲除TAM中COX-2的表达，观察和检测共培养后，乳腺癌细胞外排罗丹明能力、ADM刺激下细胞凋亡情况、Akt和GSK-3β/β-catenin通路激活情况、以及P-gp、Bcl-2及Bax的表达水平。结果：western blot及细胞免疫荧光显示，与单独培养的乳腺癌细胞相比，TAM共培养后的人乳腺癌细胞PI3K/Akt及GSK-3β/β-catenin信号通路明显激活，而NF-κB通路未见显著变化。加入PI3K/Akt通路抑制剂wortmannin或腺病毒敲除β-catenin表达可明显减少罗丹明的外排，增加乳腺癌细胞的凋亡，wortmannin可明显抑制乳腺癌细胞p-GSK-3β、active β-catenin、P-gp及Bcl-2的表达，促进Bax的表达；而敲除β-catenin表达后，P-gp及Bcl-2的表达明显降低，Bax的表达增强，但p-Akt及p-GSK-3β的表达无明显变化。相比于乳腺癌细胞单独培养液，共培养液中TGF-β、TNF-α和IL-1β无显著变化，但PGE2含量明显增加。阻断PGE2信号传导可逆转TAM介导的耐药，并抑制TAM激活的乳腺癌细胞Akt和β-catenin通路及其下游信号分子。Western blot显示，与TAM共培养前后乳腺癌细胞中COX-1及COX-2表达未见显著改变；而与M0及M1型巨噬细胞相比，TAM中COX-2表达明显增强。敲除TAM中COX-2的表达后，可显著逆转TAM介导的乳腺癌细胞耐药，并抑制TAM激活的乳腺癌细胞Akt和β-catenin通路及其下游信号分子。结论：TAM可通过过表达COX-2，促进PGE2的分泌，从而激活乳腺癌细胞PI3K/Akt通路，调控下游GSK-3β/β-catenin信号通路以及两通路下游信号分子P-gp、Bcl-2及Bax的表达，发挥促肿瘤耐药作用。