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鲜味肽作为新一代“绿色、安全”的肽类呈鲜物质,在新型鲜味调味料领域极具应用潜力。目前现有的鲜味肽制备方法多侧重于传统酶解提取和化学合成上,这两种方式存在产物纯度低或化学试剂潜在毒性的问题,急需探索一个高纯度、高产量的安全生产方式。食品微生物克隆表达外源蛋白为鲜味肽的安全、高效制备提供了一个全新的思路。大豆含有丰富的蛋白质和生物活性肽,并且味道鲜美,深受广大消费者的喜爱。从中提取获得的大豆鲜味肽（Soybean Umami Peptide,SUP,Ser-Ser-Arg-Asp-Glu-Gln-Ser-Arg）也受到广泛的关注。目前,SUP的呈味特性及食品安全规模化生产工艺研究也较为欠缺,需进一步探索。本研究以SUP为对象,采用分子对接、克隆表达、美拉德反应及高密度发酵等食品生物技术研究其食品安全高效制备工艺,并为其应用开发提供一定的参考。具体研究内容如下:首先采用PEP-FOLD3结合AutoDock vina分子对接分析SUP在添加6×His tag前后的三维结构差异及其与鲜味受体之间的相互作用关系。发现在鲜味肽SUP的C-端添加6×His tag后,只延长了SUP的α-螺旋结构,整体结构变化不大,对接结果也显示两者与鲜味受体的相互作用位点大部分相同,且添加6×His tag后相互作用氢键增多,从分子层面证实在SUP的C-端添加6×His tag可保留SUP的鲜味,是可行的。故以此作为鲜味肽SUP的表达序列,以B.subtilis 168为表达宿主菌,以自诱导表达载体pMA09srfA为SUP表达载体,构建鲜味肽安全自诱导表达系统B.subtilis168/pMA09srfA-SUP。经表达纯化后,SDS-PAGE电泳检测结果证实目标蛋白SUP成功表达,感官评价发现SUP纯化透析液的鲜味评分达到6.5分,鲜味明显。表明B.subtilis168/pMA09srfA-SUP成功构建,可作为SUP的表达工程菌,生产鲜味肽。进一步分析SUP美拉德反应呈味特性,开发其潜在应用能力。首先结合单因素实验和正交试验结果,确定最佳的美拉德反应条件为:还原糖为木糖,反应温度为120℃,反应时间为80 min,反应初始pH为7.5。对比分析美拉德反应前后呈味差异,发现SUP经美拉德反应后,鲜味有所提升,醇厚味和持续感加强,口感更鲜美滋润,苦味和酸味有所降低,还形成了肉香味、焦香味和烤香味等特征风味。表明SUP与木糖在经美拉德反应后,能有效改善SUP的整体风味,可用于制备SUP美拉德复合调味剂。为扩大鲜味肽SUP的表达量,对鲜味肽重组表达菌进行了高密度发酵研究。首先进行了摇瓶优化,获得最佳培养条件:以葡萄糖作为发酵碳源,初始葡萄糖浓度为20 g/L,NH4+浓度为0.25 mol/L,培养温度为37℃,最终菌体和SUP浓度分别达到2.773 g/L和0.128 g/L。以摇瓶优化为基础,进行分批发酵实验,最终获得最大菌体和产物积累量分别为25.57 g/L和0.97 g/L。进一步采用指数流加补料策略优化SUP高密度发酵,以提升SUP产量。结果表明,最终重组表达菌B.subtilis 168/pMA09srfA-SUP浓度达到46.21 g/L,SUP浓度达到1.76 g/L。其SUP产量是分批发酵结果的1.8倍,表明指数补料流加策略能有效提升高密度发酵产量,是一个可选的有效的补料发酵策略。