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沙门菌（Salmonella）是一种重要的人畜共患病原菌,是全球食源性传染病的主要病原体之一。鸡群感染沙门菌后不仅可以引起雏鸡死亡,还会导致成年鸡产蛋能力下降,给养禽业造成严重的经济损失。因此,为减少沙门菌的流行和传播,有效掌握沙门菌的分布流行情况对沙门菌病的疫情监控及防治有重大意义。为实现种鸡场鸡白痢的净化目标,开发灵敏、快速、准确的沙门菌抗体检测方法具有必要性。酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）是常见的实验室抗体检测方法之一,但目前特异灵敏的鸡白痢沙门菌（Salmonella Pullorum）抗体ELISA检测试剂盒较少。本研究以沙门菌O9及O12抗原单克隆抗体为基础,建立了用于鸡白痢沙门菌抗体检测的竞争性ELISA方法,旨在为我国鸡白痢的净化提供有效工具。1.2020-2021年苏皖部分地区禽沙门菌的分离鉴定及耐药性分析2020年7月至2021年6月,采集江苏和安徽部分地区禽源样品的肝脏、胆囊及盲肠进行沙门菌的分离,结合多重聚合酶链式反应（Multiplex polymerase chain reaction,mPCR）和血清凝集试验确定其血清型,利用药敏纸片法测定沙门菌分离株对21种常用抗生素的耐药性。结果显示,共计采集620份样品,共鉴定出76株沙门菌,总体分离率为12.26%（76/620）,其中鼠伤寒沙门菌（Salmonella Typhimurium）43 株（56.58%）,鸡白痢沙门菌（Salmonella Pullorum）26 株（34.21%）,肠炎沙门菌（Salmonella Enteritis）5 株（6.58%）,肯塔基沙门菌（Salmonella Kentucky）1 株（1.32%）,汤卜逊沙门菌（Salmonella Thompson）1株（1.32%）。动物分离来源显示,鸡源沙门菌32株（占42.11%）,以鸡白痢沙门菌感染为主,占比为71.88%（23/32）;鸭源沙门菌3株（占3.95%）、鹅源沙门菌33株（占43.42%）、鸽源沙门菌7株（占9.21%）和鹌鹑源分离株1株（占1.32%）,各种属来源均以鼠伤寒沙门菌感染为主,占比分别为 66.67%（2/3）、96.97%（32/33）、85.71%（6/7）和 100%（1/1）。药敏试验结果显示,分离株普遍对β-内酰胺类的青霉素、苯唑西林和大环内酯类的利福平、红霉素耐药,尤其对苯唑西林和利福平的耐药率达到了 100%和98.68%,而对喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺类和酰胺醇类药物敏感,耐药率较低,均处于20%以下,多重耐药率达78.95%（60/76）,其中鼠伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌多重耐药率分别达76.74%（33/43）和76.92%（20/26）,以上结果表明,2020-2021年江苏和安徽部分地区禽沙门菌分离株主要为鼠伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌,且多重耐药性较为普遍,应予以持续监测。2.基于沙门菌O9和O12抗原单抗竞争ELISA方法的建立将实验室前期研制的单抗O9-2C8和O12-1C5杂交瘤细胞制备腹水,进行抗体纯化和HRP标记。以鸡白痢沙门菌（Salmonella Pullorum）S6702的LPS作为包被抗原,采用棋盘法摸索竞争ELISA反应条件,针对O9和O12单抗竞争ELISA方法确定LPS抗原的包被浓度分别为1.25 μg/mL和1.875 μg/mL,O9酶标抗体和O12酶标抗体使用浓度分别为11.3 μg/mL（1:100）和2.988 μg/mL（1:80）,待测血清的稀释度分别为1:4和1:2。对竞争ELISA条件进一步优化,确定了抗原包被的条件为4℃、12 h,酶标单抗作用条件为37℃、2 h,底物作用条件为37℃、5 min。最终建立了主要用于检测O9、O12抗体的竞争ELISA方法,其中O9竞争抑制ELISA方法的阳性临界值和阴性临界值分别是35.51%和24.70%;O12竞争抑制ELISA方法中的阳性临界值和阴性临界值分别是32.27%和21.71%;介于两者之间为可疑,需重新检测。同时,O9和O12竞争ELISA方法在检测大肠杆菌（Escherichia coli）、巴氏杆菌（Pasteurella）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、普罗威登斯菌（Proverendella）时,抑制率均小于20%,为阴性反应,表明这两种方法具有良好的特异性。3.基于沙门菌O9抗原单抗竞争ELISA抗体检测试剂盒的组装和验证模拟鸡白痢沙门菌（Salmonella Pullorum）自然感染,采集血清,采用O9和O12竞争ELISA方法来定期检测每周抗体水平变化,结果显示,在早期感染（14 d、21 d）中,鸡白痢S6702组不同方法测得阳性数:玻板凝集＞O9竞争ELISA检测＞O12竞争ELISA检测,鸡白痢临床分离株0322J1组不同方法测得阳性数:玻板凝集＞O9竞争ELISA检测=O12竞争ELISA检测;在晚期感染（＞28 d）中,鸡白痢S6702组不同方法测得阳性数:玻板凝集=O9竞争ELISA检测＞O12竞争ELISA检测,鸡白痢临床分离株0322J1组不同方法测得阳性数:玻板凝集=O9竞争ELISA检测＞O12竞争ELISA检测;因此,无论是鸡白痢S6702组,还是鸡白痢临床分离株0322J1组中,O9竞争ELISA方法效果均优于O12竞争ELISA检方法,因此本研究重点组装了 O9竞争ELISA检测试剂盒。使用Proclin300防腐抑菌剂和HRP保护剂,使得ELISA试剂盒在4℃保存条件下的有效期至少达3个月。试剂盒的批内重复和批间重复变异系数均小于10%,表明该竞争ELISA试剂盒有良好的稳定性;将本试剂盒在第三方实验室与同类型试剂盒检测（Biocheck）效果比较,针对36份已知背景的血清样品（包含34份鸡白痢沙门菌阳性样品和2份阴性血清样品）检测结果显示,本试剂盒抗体阳性率为44.44%,与玻板凝集试验结果的符合率为50.00%,而Biocheck试剂盒抗体阳性率则为77.78%,与玻板凝集试验结果的符合率为83.33%。该竞争ELISA试剂盒和Biocheck试剂盒的符合率为44.44%,与Biocheck试剂盒相比较,本试剂盒测得的阳性数量较少,但其中有4个样品玻板凝集结果为阳性,本试剂盒能够检出,但却不能被Biocheck试剂盒所测出,因此本竞争ELISA试剂盒如经过后续的系统性优化后,具有潜在的应用前景。