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补体成分4(Complement component4, C4)是补体经典途径和凝集素途径中的一个重要成分,血清含量仅次于C3位居第二。在补体激活和抵抗外源微生物侵入中发挥着积极作用的C4,主要在肝脏中表达,一些肝外组织如心脏、肺脏、脾脏、肾脏、大脑、甲状腺和乳腺中也有表达。C4是补体系统中多态含量最高的成分,其结构基因位于主要组织相容性复合物区。因此,研究C4意义更显得重要。1.C4A基因多态性与奶牛生产性状关联性分析本研究以1182头中国荷斯坦牛,利用PCR-RFLP和DNA测序等方法检测牛C4A基因中未报道的单核苷酸多态性(SNPs)位点,并将发现的这些SNPs位点及其构建的不同单倍型组合与奶牛产奶性状进行关联性分析,筛查与奶牛产奶性状相关的分子标记,为培育高产奶量、高乳蛋白及高乳脂率奶牛提供参考依据。通过C4浓度、抗菌活性和补体活性三个指标,验证其抗性效果。序列分析比对显示：外显子10存在g.2994A>G突变,外显子12含g.3508A>G和g.3649G>C突变。试验群体中SNPs组成的单倍型有8种,满足统计分析数量的单倍型组合为7种。统计分析发现g.2994A>G-AG和g.3649G>C-CC个体牛的SCS较其它基因型低(P<0.01)；H5H5(GAC/GAC)为乳腺炎抗性单倍型组合,H2H1(AAG/AAC)是易感性群体。两种组合对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性差异极显著(P<0.001)；各基因型C4浓度差异不显著,但H5H7个体较H5H5高(P<0.05)。2.C4A基因可变剪切体的寻找根据体细胞评分和奶样病原菌鉴定结果,将6头奶牛分为健康组和乳腺炎组。利用RT-PCR和克隆测序技术,在肝脏和乳腺组织中发现一种形式为内含子10保留的可变剪切体,即C4A-AS.两种转录本在研究个体的心脏、’肾脏、肝脏、脾脏、肺脏、肌肉、乳腺和舌中都有表达,且在健康奶牛组织中表达差异极显著(P<0.001),在乳腺炎奶牛中差异不显著(P=0.257,)；乳腺炎发生时C4A-AS的表达量显著增加(P=0.030)。3.C4A基因启动子活性分析利用在线预测软件对牛C4A基因的5’侧翼区序列进行生物信息学分析,成功构建了一系列表达载体,利用双荧光素酶报告基因检测系统分析牛C4A基因的5’侧翼区启动活性。分别通过定点突变技术构建突变质粒和脂多糖刺激试验,研究调控C4基本表达和诱导表达的转录因子结合位点。利用EMSA技术验证转录因子在研究细胞系中存在与否。C4A基因启动子序列存在两个SNP位点,即g.-889C>T和g.+147G>A。其中,位于内含子1的g.+147G>A位点与血清C4浓度相关,可能调控C4的表达。C4A基因启动子序列转录起始位点上游169bp为报告基因荧光值最高的片段,即为启动子核心区；其中SP1(-169--158)、E-box(-122--117)和AP-1(-80--71)是调控C4基本表达的主要转录因子结合位点。其中,AP-1在脂多糖刺激C4表达中发挥作用,而且这三个转录因子在HepG2细胞系中真实存在。综上所述,C4A基因可作为奶牛乳腺炎抗性育种的候选基因。当然奶牛乳腺炎抗性育种仅仅为控制乳腺炎工作的一部分,即从“本”上治疗奶牛乳腺炎；同时在奶牛饲养中应加强管理、注重营养平衡,从“标”上减少乳腺炎的发生。