沙棘籽粕蛋白肽的制备及抗肥胖活性研究

来源 :华南理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:loveqin11
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近年来,肥胖症患者人数逐年增加,预防和治疗肥胖成为迫切需要解决的社会问题。目前市面常见的减肥产品效果不佳,且部分药品副作用较多,因此探寻一种食源类抗肥胖产品具有重要意义。沙棘籽粕为加工副产物,营养价值丰富且蛋白含量较高(约20-30%),可作为天然植物蛋白肽的来源。本文以沙棘籽粕为原料,采用不同方法制备沙棘籽粕蛋白,并对其酶解工艺进行优化,通过超滤、大孔树脂分离、固相萃取、超高压液相色谱-质谱联用和分子对接对沙棘籽粕蛋白肽进行分离纯化、结构鉴定和筛选,对合成肽段进行抗肥胖活性与机制研究,并探究合成肽的消化稳定及吸收转运特性。具体研究内容及结果如下:(1)比较了不同制备方法对沙棘籽粕蛋白色泽、结构和功能性质的影响,确定出了一种蛋白颜色浅、功能性质好的蛋白提取方法-植酸酶辅助提取法。该方法提取得到的沙棘籽粕蛋白溶解度、消化率、持油性和起泡稳定性均较高,同时具有高亮度(L*64.05)、低红度(a*9.99)和低黄度(b*14.52)的特点。经测定,植酸酶处理显著降低沙棘籽粕蛋白中植酸、原花青素(TP)、多酚(TPC)、黄酮含量(TFC)。相关性分析表明L*与TP、TPC、TF呈显著负相关(p<0.001),而a*和b*与TP、TPC、TF呈极显著正相关(p<0.001),且多酚对蛋白颜色影响较大。植酸酶可以使植酸-金属离子与蛋白质分离,同时水解产生的肌醇可为多酚等物质提供较强的极性环境,破坏多酚类物质与蛋白质之间的作用,从而减弱蛋白质的颜色。(2)以猪胰脂肪酶(PPL)抑制率为指标对沙棘籽粕蛋白酶解工艺进行了优化。单因素结合响应面结果表明底物浓度40 mg/m L,碱性蛋白酶(0.25%),p H 10.0,温度50°C,时间8 h为最优工艺,该工艺制备得到沙棘籽粕蛋白肽(SSPA)的PPL抑制率为35.12%(蛋白浓度0.8 mg/m L)。抑制动力学表明,SSPA通过形成PPL-底物-SSPA或PPL-SSPA-底物复合物非竞争性抑制PPL。SSPA中分子量小于3 k Da的肽段含量为60.54%,富含Glu、Asp和Arg。体内外抗氧化测定表明,SSPA具有清除DPPH、ABTS自由基活性、螯合亚铁离子的能力,同时能够有效降低过氧化氢对酵母细胞的损伤(存活率68.49%,相比对照组提高15%)。稳定性分析表明,SSPA具有热稳定性、p H稳定性和胃肠道消化稳定性,适量Na+和Mg2+可显著提高SSPA的PPL抑制活性,SSPA在短期贮藏过程中不会因暴露于空气而影响PPL抑制活性。(3)采用超滤得到分子量小于3 k Da的组分,经HPD826大孔树脂动态吸附之后,结合Oasis MAX小柱洗脱得到PPL抑制率较高的组分(每毫克肽PPL抑制率为88.12%)。UPLC-MS/MS鉴定得到31种多肽,结合分子对接筛选得到6个肽段,小于3 k Da组分中上述寡肽含量分别为VR(2.90%)、FR(7.40%)、RDR(1.10%)、APYR(1.50%)、NLLHR(1.40%)和EEAASLR(1.10%)。固相合成测定其IC50值分别为VR(371.07μg/m L)、FR(243.07μg/m L)、RDR(250.50μg/m L)、APYR(350.41μg/m L)、NLLHR(220.70μg/m L)、EEAASLR(510.55μg/m L)。分子对接表明以上多肽通过亲水、氢键、疏水、π-π相互堆积和范德华相互作用与PPL结合。Pearson相关性分析表明,分子对接结合能高低与沙棘籽粕蛋白肽的PPL抑制率强弱之间存在显著正相关(r=0.865,p<0.05)。(4)在0.2-1.0 mg/m L范围内,VR、FR、RDR、APYR、NLLHR和EEAASLR均可有效抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖(抑制率20-70%),其中APYR抑制效果最佳(IC50=0.35 mg/m L)。流式细胞检测表明,APYR能够阻滞3T3-L1增殖过程中的G2-M期,减少G0-G1期的细胞数目。以上寡肽(0.2 mg/m L)能够有效抑制3T3-L1细胞的分化和甘油三酯(TG)含量的积累(抑制率60-98%),其中APYR效果最佳(抑制率76.24%)。分化8 d时APYR处理组的细胞甘油释放量最高(109.44μM),约为模型对照组的2.06倍,其他处理组细胞的甘油释放量约为模型对照组的1.50-1.80倍。RT-q PCR和WB分析表明,高剂量VR、FR、RDR、APYR、NLLHR和EEAASLR(0.2 mg/m L)能够激活c GMP-PKG通路,可磷酸化HSL和AMPK。一方面促进HSL发挥脂解作用,减少细胞中脂滴数目;另一方面,磷酸化AMPK可抑制PPARγ、C/EBPα、FAS的表达,从而抑制脂肪细胞分化,减少脂肪酸合成。AMPK还可激活CPT-1和PGC1α的表达,促进线粒体内脂肪酸的β氧化。(5)胃肠道模拟消化表明,除APYR之外,其余肽段抑制前脂肪细胞增殖和分化的能力降低。APYR经胃肠道消化之后可保留86.56%的原始肽段,进入肠道后,49.10%的APYR可经小肠上皮细胞转运至血液,其Papp为3.03×10-6cm/s,属于易吸收肽。而其余5种多肽的肽段保留率和转运率显著低于APYR。结构-转运能力分析表明,分子量和电荷对沙棘籽粕蛋白肽转运量的影响较大,疏水性对于转运量的影响随着肽分子量的增加而被掩盖掉,肽分子中Val和Arg的存在可以促进其跨膜转运,而Pro的存在可降低肽酶水解,增加其吸收量。
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