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多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)是一种革兰阴性条件致病菌,根据荚膜抗原的特异性,可将其分为A、B、D、E和F这5个血清型。A型多杀性巴氏杆菌在牛群中主要引起牛肺炎,与其他病原菌共感染时可引起严重的呼吸道疾病综合征,给养牛业带来了巨大的经济损失。目前对牛源A型多杀性巴氏杆菌的致病机制尚不清楚。近年来,许多研究表明,肠道微生物对疾病的发生发展有着非常重要的影响。本实验室前期研究发现,在一定剂量范围内,牛源A型多杀性巴氏杆菌人工感染小鼠后,部分小鼠表现为重症死亡,部分小鼠表现为轻症并存活(其他病原也有类似现象),但其具体机制不明。本研究聚焦肠道微生物对小鼠感染多杀性巴氏杆菌的影响,具体试验探索与结果如下:1.牛源A型多杀性巴氏杆菌Pm CQ6感染模型建立随机选取10只SPF级雌性昆明小鼠,采用2.65×10~7CFU的Pm CQ6腹腔注射,得到较为稳定的存活率为50%左右的重症轻症感染模型,观察小鼠临床表现、细菌肺部定殖和肺部病理损伤情况。结果发现,感染后前2-4天小鼠体重普遍下降,之后病症严重的小鼠体重持续下降直至死亡(重症死亡组,DG),而病症较轻的小鼠4-5天后体重回升,逐渐接近对照组小鼠体重最终恢复健康状态(轻症恢复组,SG);Pm CQ6在不同小鼠肺部定殖也存在显著差异,DG小鼠肺部平均定殖可达2.5×10~7CFU/g,而SG小鼠肺部平均定殖3.2×10~6CFU/g。小鼠肺组织HE染色结果显示,Pm CQ6感染对小鼠肺组织造成组织结构病变和炎性病变,DG小鼠上皮细胞脱落明显,组织充血和炎性渗出;进一步通过ELISA检测肺组织炎性细胞因子表达情况,发现Pm CQ6感染后小鼠肺组织中促炎因子如IL-6、IL-12、IL-17、IL-1β、IFN-γ、TNF-α等表达上升,而且在DG组的表达极显著高于SG组。以上结果表明本试验建模成功。2.肠道微生物对小鼠感染牛源A型多杀性巴氏杆菌的影响2.1肠道微生物清除试验为了解肠道微生物在Pm CQ6感染小鼠中是否发挥作用,随机选取SPF小鼠(n=6),首先通过饮水添加联合抗生素(氨苄西林、新霉素、甲硝唑和万古霉素)处理7天,清除小鼠肠道微生物,间隔2天后腹腔注射Pm CQ6(5.7×10~6CFU),观察小鼠死亡情况。结果发现,饮水添加抗生素7天后,小鼠粪便微生物数量急剧下降(由平均1010CFU/g降为平均不足10~3CFU/g并至稳态),表明肠道微生物清除成功;且抗生素处理的小鼠在一周后存活率约为34%,而对照组正常饲喂的小鼠存活率约为83%,清除小鼠肠道微生物后小鼠存活率下降了49%,说明抗生素清除肠道微生物后小鼠感染Pm CQ6具有较高致死性。2.1粪便移植试验通过粪便移植试验,进一步确定肠道微生物在牛源A型多杀性巴氏杆菌感染小鼠中的作用。选取SPF小鼠30只,随机分为试验组(n=20)与对照组组(n=10)只,用2.65×10~7CFU Pm CQ6感染小鼠,收集感染后32h的小鼠粪便(DG组和SG组),同时收集对照组小鼠(未感染)粪便(NC组)。将粪便用0.1um细胞滤网过滤收集细菌,通过灌胃将100μL含有1×10~8CFU细菌(DG组、SG组和NC组)的生理盐水悬浮液及100μL生理盐水分别添加至抗生素预处理的小鼠(每组10只);1天后用Pm CQ6(2.65×10~7CFU)去感染这几组小鼠,比较其死亡率。结果发现,添加DG粪便组在4天内全部死亡,生理盐水组存活30%;添加NC粪便组死亡时间与存活数量与建模一致,在30h之后开始死亡,存活率50%;添加SG粪便组感染Pm CQ6后死亡时间延后且存活率达到80%。综上结果表明,肠道微生物对小鼠感染牛源A型多杀性巴氏杆菌后的疾病进程发挥重要作用。3.小鼠肠道微生物组及代谢组测序结果分析2.65×10~7CFU Pm CQ6感染32h后,采集感染后小鼠肠道内容物(n=28)以及注射等量无菌生理盐水小鼠的肠道内容物(n=10)进行微生物(16SRNA)组和代谢组测序。同时设计观察组(n=30只)进行相同感染处理,持续观察12天计算死亡率,结果显示小鼠存活率为60%,与前面建模基本一致,说明感染模型的稳定与后续试验的可信性。3.1微生物组测序结果分析对微生物组测序结果进行质量评估,CG含量在51.22%-54.92%之间,Q30分值(质量值大于等于30的碱基占总碱基数的百分比)95%以上,表明测序结果稳定可靠。对测序原始数据统计分析发现,小鼠感染Pm CQ6后,从门水平比较,对照组主要由厚壁菌门和拟杆菌门组成,占总体的90%以上,其中厚壁菌门占70%左右;放线菌门和变形菌门在整体中一共占比不足10%。而试验组占比较多的是50%左右的厚壁菌门,30%以上的拟杆菌门,不足15%的变形菌门,放线菌门占比低于0.1%。从属水平分析,对照组占比最显著的是70%左右的乳酸杆菌,双歧杆菌和脱硫弧菌各占大约5%;与对照组相比,试验组乳酸杆菌占总体的不足30%,双歧杆菌和脱硫弧菌也显著下调,而拟杆菌、毛螺菌、埃希氏菌属的细菌显著上调。3.2靶标微生物筛选根据微生物属水平物种聚类热图,结合感染小鼠死亡情况等一系列病理状况,进一步筛选与宿主感染巴氏杆菌相关的肠道细菌。结果显示,将与对照组样本距离较近的感染小鼠样本归为一组(轻症组,SG),将与对照组样本距离较远的感染小鼠样本归一组(重症组,DG)。对SG、DG以及对照组小鼠的肠道菌群比较发现,SG肠道菌群组分与对照组相似,DG与SG及对照组菌群差异较大。DG相比SG,乳酸杆菌、双歧杆菌极显著下调,普雷沃氏菌、拟杆菌、脱硫弧菌、布劳氏菌属等细菌上调。对此,我们猜测这些菌群的差异,可能是影响宿主感染Pm CQ6后发展为重症或是轻症的原因。3.3代谢组学测序结果分析代谢组测序结果采用正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)的统计方法进行验证,显示测序结果稳定可靠。差异物质筛选结果表明,试验组与对照组相比,半乳糖醇显著下调,而短链脂肪酸(3-羟基丙酸、3-甲基苯乙酸)显著上调;KEGG分析显示,试验组与对照组在半乳糖代谢通路具有显著差异。4.乳酸杆菌对宿主感染Pm CQ6的影响基于靶标微生物筛选结果,从健康小鼠肠道内容物中分离到5株乳酸杆菌,包括4株约氏乳杆菌和1株罗伊氏乳杆菌。选取SPF小鼠,随机分为试验组和对照组(每组10只),分别连续灌胃罗伊氏乳杆菌和其中2株约氏乳杆菌(L.johnsonii MH33和L.johnsonii LB-19),对照组灌胃MRS液体培养基1周后,经腹腔注射Pm CQ6,对比几组小鼠临床表现和免疫反应状况。结果显示,试验组小鼠连续灌胃L.johnsonii MH33一周后感染Pm CQ6的存活率为70%,明显高于对照组(对照组存活率20%),而其余几株乳酸杆菌并无明显作用;细菌定殖检测结果发现,感染32h后,Pm CQ6在灌胃L.johnsonii MH33小鼠肺组织定殖为2.0×10~7CFU/g,而对照组小鼠肺组织平均含菌量达到3.2×10~8CFU/g;ELISA检测也发现,感染Pm CQ6后,灌胃L.johnsonii MH33小鼠相比对照组IL-6、IL-12、IL-17、IL-1β、IFN-γ等炎性因子表达下调。以上结果说明,添加L.johnsonii MH33,可通过降低Pm CQ6感染引起的小鼠炎性反应对小鼠起到保护作用。