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血栓栓塞性疾病是人类的常见病和多发病,严重危害人类健康。血小板活化和聚集在血栓的形成中发挥着重要作用,因此抗血小板治疗仍是临床上预防和治疗血栓性疾病的重要手段。虽然目前抗血小板药物已取得显著的临床疗效,但所引起的致死率和致残率仍然很高。因此,寻找新的靶点研制新的药物,减少出血风险的发生,依然是目前抗血小板聚集药物研究的热点和难点。本实验中,我们研究了单环刺螠糖胺聚糖(GAG)对ADP体外诱导激活的大鼠血小板聚集功能的影响。采用酶联免疫吸附、荧光探针、蛋白质免疫印迹、流式细胞术和实时荧光PCR等方法等方法,探究了体内/外GAG给药对大鼠血小板信号通路转导的影响。结果表明,GAG剂量依赖性显著抑制体外ADP诱导的大鼠的血小板聚集和粘附(P<0.05,P<0.05),显著抑制ADP诱导的血小板而对TXA2的释放和cPLA2的磷酸化(P<0.01,P<0.05),而对血小板COX-1表达无明显影响(P>0.05),提示GAG对cPLA2活性的抑制可能是血小板活化过程中TXA2产生和释放减少的始因;胞外不提供Ca2+的条件下,GAG显著抑制ADP诱导的血小板胞浆Ca2+浓度升高(P<0.05),胞外添加Ca2+时,胞浆[Ca2+]i迅速升高,与对照组相比没有显著差异(P>0.05),提示GAG主要抑制血小板颗粒Ca2+释放而并不参与离子通道介导的Ca2+内流;GAG显著抑制ADP诱导的血小板P-选择素表达和磷脂酶C的磷酸化(P<0.01,P<0.05),PLC活性被抑制的同时导致了下游IP3含量显著减少(P<0.05),推断GAG通过经典的PLC信号通路抑制血小板颗粒Ca2+释放和胞内[Ca2+]i的升高,从而抑制血小板的活化。GAG对血小板受体P2Y1和P2X1受体mRNA的表达均无显著影响(P>0.05,P>0.05),对ADP诱导的血小板PI3K表达和Akt的磷酸化均无显著影响(P>0.05,P>0.05),表明GAG并不通过PI3K/Akt信号通路发挥作用;GAG对ADP诱导的血小板p38MAPK和ERK磷酸化具有强抑制作用(P<0.01,P<0.01),提示GAG可能参与并抑制MAPK信号通路的多信号级联反应,其对血小板MAPK信号转导通路的抑制作用有可能作为其抗血小板激活的重要靶点。GAG显著抑制血小板PKC的磷酸化以及血小板表面黏附分子GPⅡ b/Ⅲa的表达,相比对照组差异显著(P<0.01,P<0.01),证实GAG可以抑制血小板粘附受体的表达从而抑制血小板聚集。