研究背景Klotho基因具有潜在抗衰老作用。小鼠Klotho表达缺陷可出现几乎全部与人类衰老类似的表型。人类Klotho基因与小鼠具有同源性,二者之间蛋白序列有86%的相似性,提示Klotho基因变异可能参与人类衰老进程。已有研究表明人类Klotho基因单核苷酸多态性位点与多种增龄性疾病密切相关。Klotho缺陷小鼠两个显著的变化是动脉硬化和内皮功能障碍,这与人类高血压的病理特点非常相似。但目前为止汉族人群中Klotho基因SNP与高血压的相关性研究未见报道。研究目的本研究拟通过病例对照研究,观察Klotho基因启动子区G-395A单核苷酸多态性(SNP)与原发性高血压的相关性。通过双荧光素酶报告基因实验进行启动子缺失突变,对G-395A位点在启动子区的功能进行定位,结合定点突变,了解该位点G/A替换对Klotho基因转录调控的影响。方法1、本研究选择2006年2月至2008年5月期间西南医院老年科门诊、住院及体检的高血压患者215例及非高血压对照220例为研究对象,各研究对象之间无亲缘关系。运用Taqman等位基因特异性杂交分析对各研究对象进行SNP分型,对高血压组和对照组间年龄、性别、吸烟史、糖尿病、高血脂、体重指数等高血压的传统影响因素及基因型分布进行比较,并进一步针对年龄、性别和吸烟史进行亚组分析。运用logistic回归模型分析了各个危险因素对高血压的相对危险度。为排除G-395A多态性在人群中可能造成的生存效应,对G-395A基因型在各年龄段之间的分布也进行了比较。2、全部研究对象中,有232例检测了臂踝脉搏波传导速度(baPWV)和血浆一氧化氮(NO)的影响,以初步了解G-395A多态性对血管功能的影响。3、在生物信息学预测的基础上,采用双荧光素酶报告基因实验,对Klotho基因启动子序列进行缺失突变分析。将包含Klotho启动子区-975bp～-8bp、-506bp～-8bp、-320bp～-8bp、-145bp～-8bp四个片断克隆入pGL3-Basic报告基因质粒,和pRL-TK内参质粒共转染HEK293细胞,检测双荧光素酶活性,分析各片断的启动活性,对G-395A位点进行启动子区的功能定位。4、将包含G-395A位点且具有启动子活性的-506bp～-8bp片断克隆入pGL3-Enhancer荧光素酶报告基因质粒,进一步证实其启动子活性。5、运用重叠延伸PCR技术对包含-506bp～-8bp片断的pGL3-Basic及pGL3-Enhancer重组质粒进行-395G/A定点突变,将各重组质粒分别和内参质粒pRL-TK共转染HEK293细胞,比较G/A替换对报告基因活性的影响。结果1、在435例研究对象中存在GG、GA、AA三种基因型,分别为GG型288例(66.2%),GA型130例(29.9%),AA型17例(3.9%),A等位基因频率为0.191,G等位基因为0.809,符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.107,P=0.948)。2、高血压组和对照组间年龄、吸烟史、体重指数、糖尿病患病率有差异,而性别、高血脂症在两组间无差异。G-395A多态性基因型的分布在两组之间存在差异,有统计学意义(χ2=6.883,P=0.032)。亚组分析显示在大于60岁亚组、女性亚组、非吸烟亚组中G-395A基因型分布有差异(P = 0.039, P = 0.001及P = 0.010),而年龄小于60岁亚组、男性亚组及吸烟亚组基因型分布无统计学差异。Logistic回归分析显示调整年龄、性别、吸烟史、体重指数、糖尿病、高血脂症等传统危险因素后,G-395A多态性仍然与高血压有相关性,-395A等位高血压呈负相关(OR=0.593,95% CI=0.376～0.935,P=0.024)。3、G-395A多态性在研究人群中各年龄段之间的分布无统计学差异(P=0.071),提示G-395A多态性在本研究的人群中未造成明显生存效应。4、-395A等位携带者平均baPWV较非携带者显著降低(1463.8±297.0 vs. 1572.6±347.1,P=0.014)。-395A等位携带者平均血浆NO与非携带者之间无统计学差异(11.8±6.6 vs. 11.1±6.7,P=0.448)。5、成功将Klotho基因5′侧翼-975bp～-8bp、-506bp～-8bp、-320bp～-8bp、-145bp～-8bp四个片断克隆入pGL3-Basic报告基因质粒。通过RT-PCR证实HEK293细胞可表达Klotho基因。双报告基因实验结果显示-975bp～-8bp、-506bp～-8bp片断均具有启动子活性(和pGL3-Basic空质粒相比,P=0.014及P<0.001)。将-506bp～-8bp片断克隆入pGL3-Enhancer质粒,其报告基因活性较相对应pGL3-Basic重组质粒明显增强(P<0.001)。提示G-395A位点可能参与Klotho基因核心启动子构成或接近核心启动子区。6、成功对包含Klotho基因-506bp～-8bp片断的pGL3-Basic和pGL3-Enhancer重组质粒进行了-395G/A突变。双报告基因活性分析显示-395G/A替换增加了pGL3-Basic重组质粒中相对荧光素酶活性,但其影响无统计学意义(0.043±0.09 vs. 0.028±0.012; P=0.094),而在pGL3-Enhancer重组质粒中-395G/A替换后显示出更高的相对荧光素酶活性(0.251±0.084 vs. 0.103±0.013; P=0.013)。结论本研究在重庆汉族人群中发现Klotho基因G-395A SNP与高血压易感性相关,-395A等位有可能是高血压遗传学保护因素。在人群中-395A等位携带者动脉僵硬度较非携带者低,提示-395A等位有潜在改善动脉功能的作用。Klotho基因G-395A位点可通过G/A替换提高Klotho基因转录活性起到抗高血压作用,是潜在的调节性SNP位点。