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目的:牙周炎是牙菌斑中的微生物所引起的牙周支持组织的慢性感染性疾病,可导致牙周支持组织的破坏。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)是牙周炎的主要致病菌,可以通过多种途径逃避宿主天然免疫系统的防御。巨噬细胞是机体内重要的效应细胞,其可以活化为不同的表型如经典活化巨噬细胞(M1型)和选择性活化巨噬细胞(M2型)。PG0352是P.gingivalis W83中唯一编码唾液酸酶的基因。我们构建了P.gingivalis W83唾液酸酶基因突变株(ΔPG0352)。研究发现该突变株更易于被巨噬细胞所清除,并且这种作用可能与ΔPG0352促进巨噬细胞的M1极化有关。因此,我们推测ΔPG0352可能是通过促进巨噬细胞的M1极化,进而增强巨噬细胞的免疫清除能力。本研究目的是利用P.gingivalis W83、ΔPG0352、回复株comΔPG0352和E.coli分别感染巨噬细胞,检测它们对巨噬细胞极化、抗原提呈能力和吞噬能力的影响,并建立大鼠牙周炎模型验证体外实验的结果。旨在探索唾液酸酶基因缺失对巨噬细胞极化及吞噬能力的影响,为慢性牙周炎的预防和治疗提供新的研究思路和理论基础。研究方法:利用PMA诱导人单核细胞U937分化为M0型巨噬细胞,流式细胞术检测巨噬细胞标志物CD68的表达。利用P.gingivalis W83、ΔPG0352、comΔPG0352和E.coli分别感染U937细胞分化成的巨噬细胞,采用透射电镜观察巨噬细胞活化后的形态变化和巨噬细胞对不同菌株的吞噬活性;采用ELISA检测不同菌株感染巨噬细胞后M1极化标志物IL-12和iNOS以及M2极化标志物IL-10和Arg-1的水平,流式细胞术检测M1型极化标志物CD80和M2型极化标志物CD206的表达并定量检测巨噬细胞对不同菌株吞噬能力的差异,利用免疫荧光检测巨噬细胞表面分子MHC-II的表达。通过P.gingivalis W83、ΔPG0352和comΔPG0352感染大鼠牙周组织建立大鼠牙周炎模型,免疫组化分析大鼠牙龈组织中M1型极化标志物iNOS和M2型极化标志物CD163的表达差异,采用体视显微镜分析大鼠牙槽骨吸收情况。结果:1、PMA可以诱导人单核细胞U937分化为M0型巨噬细胞,流式细胞术检测U937细胞表面几乎不表达CD68,而在PMA诱导下的M0型巨噬细胞表面CD68表达达到95.4%,CD80及CD206不表达。2、透射电镜观察巨噬细胞活化后的形态变化和巨噬细胞对不同菌株的吞噬活性,对照组巨噬细胞膜表面光滑且完整,而经四种菌株感染后的巨噬细胞表面有微绒毛和指状突起,膜变得不连续。细胞内可见被吞噬的细菌,这些细菌被包裹在内吞液泡内。3、ELISA检测IL-12、iNOS、IL-10和Arg-1的水平,与对照组相比,实验组IL-12、iNOS、IL-10和Arg-1的水平均有所增加。E.coli和ΔPG0352组IL-12和iNOS的水平高于P.gingivalis W83和comΔPG0352,且E.coli组高于ΔPG0352组(P<0.05)。E.coli和ΔPG0352组IL-10和Arg-1的水平低于P.gingivalis W83和comΔPG0352组,且E.coli组较ΔPG0352组低(P<0.05)。四个指标在P.gingivalis W83和comΔPG0352组之间的差异均无统计学意义。4、流式细胞术及免疫荧光检测巨噬细胞表面分子CD80、CD206和MHC-II的表达,实验组CD80、CD206和MHC-II的表达均高于对照组。其中,P.gingivalis W83、ΔPG0352和E.coli组CD80的表达依次增高(P<0.05)。P.gingivalis W83、ΔPG0352和E.coli组CD206的表达依次降低(P<0.05)。三个指标在P.gingivalis W83和comΔPG0352组之间的差异均无统计学意义。5、流式细胞术定量检测巨噬细胞对不同菌株吞噬能力的差异,巨噬细胞吞噬P.gingivalis W83的阳性率约为52.5%,对ΔPG0352的吞噬能力增强约为70.4%,两者之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。巨噬细胞吞噬E.coli的阳性率约为85.7%,与P.gingivalis W83和ΔPG0352组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。而P.gingivalis W83和comΔPG0352组之间的差异不具有统计学意义。6、利用P.gingivalis W83、ΔPG0352和comΔPG0352感染大鼠牙周组织建立大鼠牙周炎结扎模型,分析大鼠牙槽骨吸收情况得知,A组(对照组)为健康大鼠牙槽嵴顶位置,牙槽骨无吸收,边缘光滑。B组(PBS+结扎丝组)吸收程度最轻为585.40±65.75μm。C组(P.gingivalis W83+结扎丝组)和E组(comΔPG0352+结扎丝组)吸收程度最重,分别为1680.40±121.37μm和1694.20±86.46μm,两组间差异不具有统计学意义。D组(ΔPG0352+结扎丝组)与C组和E组相比,牙槽骨吸收程度减轻,为1229.80±99.55μm(P<0.05)。分析大鼠牙周组织免疫组化结果得知,C、D和E组iNOS和CD163的表达量均高于A和B组(P<0.05)。其中,C和E组iNOS和CD163的表达均高于D组(P<0.05)。C和E组之间差异均不具有统计学意义。A和B组间差异均不具有统计学意义。结论:P.gingivalis W83唾液酸酶缺乏可以促进巨噬细胞向M1型极化,增强巨噬细胞的吞噬能力,从而抑制P.gingivalis W83对宿主免疫系统的逃逸。