在我国,消化道恶性肿瘤中大肠癌发病占有很高的比率。目前以手术治疗为主的综合治疗仍存在局限性,疗效不尽人意。因此,能否找到一个有效的分子治疗靶点,是丰富大肠癌治疗方法和最终应用于临床提高综合疗效的关键。有研究表明,大肠癌标本中端粒酶活性表达高达85%以上,而正常组织表达仅5%左右。端粒酶全酶由端粒酶RNA (hTR)、端粒酶相关蛋白(TPI)和端粒酶催化亚基(hTERT)三部分组成。hTR和TPI在正常组织和肿瘤组织均有表达,与端粒酶活性无相关性。而hTERT与端粒酶的活性相一致,hTERT基因是合成端粒酶全酶的限速因素,与肿瘤的关系尤为密切,因此将端粒酶作为肿瘤分子靶点的研究是极有意义的研究领域。本研究从本院临床收集30例大肠癌组织、癌旁组织及正常大肠组织,通过对端粒酶活性的检测,探讨端粒酶与大肠癌的相关性,并进一步验证端粒酶催化亚基(hTERT)的表达是否与端粒酶活性一致。同时回顾性分析本院178例大肠癌患者病理标本中hTERT表达水平和临床病理学参数之间的相关性；通过临床随访资料分析,阐明影响大肠癌患者生存预后的风险因素,明确hTERT能否作为判断大肠癌预后的标志物及作为大肠癌治疗的分子靶点。通过RNAi沉默技术,观察hTERT沉默对大肠癌细胞生长增殖和凋亡的影响,最终阐明hTERT基因RNAi沉默技术对大肠癌靶向治疗的可行性。本研究将从细胞、分子和整体水平上,为开展大肠癌hTERT基因靶向治疗提供实验和临床依据。第一部分端粒酶与大肠癌相关性研究第一章端粒酶活性与大肠癌相关性研究目的探讨端粒酶与大肠癌相关性,进一步验证端粒酶催化亚基(hTERT)的表达是否与端粒酶活性一致。方法运用PCR-TRAP-ELISA及免疫组织化学方法对大肠癌组织及其癌旁组织、大肠正常组织各30例检测端粒酶活性、hTERT的表达水平,并研究端粒酶与临床病理学特征之间的关系。结果(1)端粒酶阳性检出率在大肠癌组织、癌旁组织、大肠正常组织分别为83.33%13.33%3.33%,癌组织中检出率明显高于其他组织(P<0.05)。(2)大肠癌组织端粒酶活性随组织分化程度变低而升高,低分化大肠癌组织中的端粒酶阳性表达率高于中分化及高分化大肠癌(P<0.05)。(3)通过用免疫组化检测hTERT的表达与PCR-TRAP-ELISA法检测得端粒酶活性相比较,显示端粒酶活性与hTERT表达具有一致性,两法检测无显著差异。结论(1)大肠癌组织端粒酶阳性率明显高于癌旁组织及正常大肠组织,大肠癌组织中hTERT表达高于癌旁组织及正常组织。(2) hTERT的表达与端粒酶活性一致。第二章端粒酶催化亚基与大肠癌预后因素分析目的通过对178例大肠癌患者的临床资料回顾性分析,阐明hTERT表达水平与大肠癌临床病理特征及预后的关系,为大肠癌患者的预后评估提供一定的理论指导。方法选取有完整临床资料的178例大肠癌石蜡包埋组织标本及60例癌旁组织标本作为实验组,30例大肠正常组织石蜡包埋标本作为对照组。采用免疫组化的方法检测大肠癌组织中hTERT蛋白表达水平。查阅病例获得相关临床参数资料及随访资料,分析hTERT表达水平与大肠癌进展及临床预后的关系。结果(1) hTERT蛋白在大肠癌组、癌旁组与大肠正常组中阳性率分别为94.4%、6.67%、3.33%,其差异有统计学意义(P<0.001);(2) hTERT在大肠癌组织中的表达与性别、年龄、淋巴结转移、肿瘤直径无关(P>0.05),与肿瘤分化程度、浸润深度、Dukes分期、临床分期及远处转移有关(P<0.05)。(3)经多因素Cox模型分析,不同浸润深度、远处转移、淋巴结转移、hTERT表达4项指标是影响大肠癌患者术后预后的独立危险因子；hTERT表达水平与患者术后无瘤生存时间呈负相关。结论hTERT在大肠癌组织中呈高表达。经多因素Cox分析,大肠癌浸润深度、远处转移、淋巴转移、hTERT表达与大肠癌患者预后存在显著性相关,是影响预后的危险因子。大肠癌组织中hTERT高表达者预后相对较差,低表达者预后相对较好。第二部分RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌的实验研究第一章hTERT基因shRNA真核表达载体的构建目的构建人端粒酶催化亚基(hTERT)基因shRNA真核表达载体质粒,为大肠癌RNAi介导的基因治疗打下基础。方法化学合成3条hTERT基因siRNA,通过脂质体转染大肠癌细胞SW480,48h后采用RT-PCR方法筛选出一条对hTERT mRNA有明显沉默作用的siRNA。将筛选出的siRNA设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链后,插入到pGPU6/GFP/Neo真核表达载体中,并进行酶切和测序鉴定。结果酶切和DNA测序证实构建的ShRNA已插入载体中。结论成功构建的hTERT基因shRNA真核表达载体pGPU6/GFP/Neo-hTERT shRNA,为进一步开展hTERT基因在人大肠癌细胞中的作用机制及体内外RNAi实验研究奠定了基础。第二章RNAi沉默hTERT基因对大肠癌SW480细胞生物学特性的影响目的观察hTERT基因对SW480细胞生物学特性的影响。方法将重组质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT shRNA (hTERT-shRNA)用脂质体转染法导入SW480大肠癌细胞,含无效序列的pGPU6/GFP/Neo-NC shRNA (NC-shRNA)作为阴性对照,单纯SW480细胞作为空白对照,等量转染试剂脂质体作为脂质体对照组,分别于转染后24h、48h、72h,在荧光显微镜下观察重组质粒转染效率和细胞形态学变化。采用MTT法检测各组细胞的生长增殖情况,RT-PCR法检测不同转染时间细胞hTERT mRNA的表达水平,免疫细胞化学法检测hTERT特异性蛋白表达；PCR-TRAP-ELISA法检测转染后48小时端粒酶活性；流式细胞仪检测转染后细胞周期分布,TUNEL法和透射电镜观察转染后细胞凋亡变化及线粒体膜电位(MMP)的改变检测。结果(1) hTERT-shRNA质粒转染24h、48h及72h比较,转染48h其转染效率明显高于24h和72h的转染效率,质粒与脂质体比例为1：2.5时,其转染效率显著高于其它各组,转染率达59%。(2)MTT检测结果显示：hTERT-shRNA质粒转染组对SW480细胞的生长增殖有明显抑制作用,于转染后第2d达到峰值,增殖率减少达28.22%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。(3)半定量RT-PCR结果显示,转染48小时的hTERT-shRNA组的hTERT mRNA表达量明显低于转染24h和72h组的表达量。转染48小时的hTERT-shRNA组和空白对照组、脂质体对照组、NC-shRNA组比较,其抑制率分别是39.20%,33.28%,27.95%。(4)免疫细胞化学结果示：hTERT-shRNA组染色阳性细胞明显少于对照组。经病理图像分析软件进行灰度测量后比较发现,转染48h的hTERT-shRNA组较空白对照组灰度值下降约30.2%,同时和脂质体对照组和NC-shRNA组相比,差异均有明显统计学意义(P<0.01)。(5)PCR-TRAP-ELISA端粒酶活性检测显示：较空白对照组相比,hTERT-shRNA转染组细胞端粒酶活性下降了18.7%,与较其它三组之间差别均有显著性意义(P<0.05)。(6)流式细胞术检测：与对照组比较,hTERT-shRNA组G0/G1期细胞显著增加。与NC-shRNA组比较,hTERT-shRNA组增殖指数(PI)下降14.2%,差别有显著学意义(P<0.05)。(7) TUNEL法检测：hTERT-shRNA组凋亡细胞数显著多于对照组,因而其凋亡指数较其它组也明显增高,hTERT-shRNA组较空白对照组AI增高20%。(8)转染48h后透射电镜观察：可见凋亡细胞体积明显缩小,表面突起和微绒毛减少,甚至消失,染色质不均匀地地沿核膜下聚集。部分可见细胞核新月体,空泡形成增多。(9)与空白对照组相比,转染48h后线粒体跨膜电位(MMP)显示：hTERT-shRNA组线粒体Rhodamine123荧光强度明显增强(增加约24.2%),MMP显著下降,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论RNAi沉默hTERT基因能有效抑抑制SW480肿瘤细胞生长和增殖,并降低端粒酶活性,诱导肿瘤细胞凋亡。第三章RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌移植瘤的动物实验研究目的探讨重组pGPU6/GFP/Neo-hTERT shRNA质粒对SW480细胞裸鼠移植瘤的生长抑制作用。方法(1)经皮下接种SW480细胞株(1×107个细胞/只)建立裸鼠人大肠癌细胞移植瘤模型。(2)24只裸鼠随机地分为3组,每组8只。以瘤内接种pGPU6/GFP/Neo-hTERT shRNA简称hTERT-shRNA)质粒组为实验组,以瘤内注射pGPU6/GFP/Neo-NC shRNANC (简称NC-shRNA)作为阴性对照,以瘤内注射生理盐水作为空白对照组。(3)观察各组裸鼠皮下肿瘤生长情况,绘制肿瘤生长曲线,计算肿瘤抑制率。(4)治疗结束后取标本进行病理学检查、hTERT mRNA及hTERT蛋白表达分析,端粒酶活性及组织凋亡检测。结果(1)所有裸鼠均于7天后可见皮下肿瘤形成。(2) hTERT-shRNA组裸鼠肿瘤生长较慢,生理盐水对照组和NC-shRNA阴性对照组裸鼠肿瘤仍较快增大。(3)hTERT-shRNA组肿瘤组织切片HE染色,部分肿瘤可见大片坏死区,细胞结构消失。生理盐水组和NC-shRNA组肿瘤生长良好,细胞形态不规则,可见病理性核分裂相。(4)半定量RT-PCR检测hTERT mRNA水平,发现hTERT-shRNA组较生理盐水对照组和NC-shRNA阴性对照组分别下降52.1%和48.3%,差异具有显著性意义(P<0.01)。(5)免疫组化结果表明：hTERT-shRNA组肿瘤组织中hTERT阳性细胞明显减少,蛋白表达下调。hTERT蛋白平均灰度较生理盐水组和NC-shRNA组分别降低19.9%和14%。(6)端粒酶活性检测表明,pGPU6/GFP/Neo-hTERT组较生理盐水组和NC-shRNA组端粒酶活性明显降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。端粒酶活性抑制率分别为48.5%和53.0%。(7)TUNEL法检测发现,hTERT-shRNA组肿瘤细胞凋亡明显多于对照组,AI(凋亡指数)较生理盐水组和NC-shRNA组增加29.4%,31.1%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论hTERT基因的shRNA瘤内注射能延缓大肠癌细胞SW480裸鼠皮下移植瘤的生长,其机理可能是通过抑制hTERT mRNA和蛋白的表达、抑制端粒酶的活性、促进肿瘤细胞凋亡而发挥作用。