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昆虫作为一种变温动物,高温胁迫对其生长发育及繁殖产生不利影响。此外,全球气候变暖的加剧带来平均气温的升高和高温事件的频发,给昆虫带来了更大的挑战。在长期的进化过程中,昆虫逐步形成了一套基于行为、生理生化及遗传上的应对高温的响应机制。松墨天牛（Monochamus alternatus）是我国南方松林的一种重要蛀干害虫,也是我国重大检疫性森林病害—松材线虫病的主要媒介昆虫,对我国森林资源从经济上和生态上都造成了巨大的损失。松墨天牛主要分布于我国东南部地区,成虫在野外常常面临37.5℃及以上的高温天气。松墨天牛的耐热性及耐热机制直接影响其在气候变暖条件下的种群动态和地理分布,进而间接影响松材线虫病的扩散蔓延。热激蛋白（Heat Shock Protein,HSP）是一类分子伴侣,可在生物体遭遇热胁迫时保护底物蛋白热变性聚集和非正常降解,是昆虫应对高温胁迫的生理生化响应的重要组成部分。为探究松墨天牛在高温胁迫下的响应机制,本论文在明确松墨天牛成虫对高温胁迫的耐受性基础上,以热激蛋白为研究对象,利用基因克隆、荧光定量PCR、蛋白免疫印记和免疫荧光染色等技术,系统探究高温胁迫下HSP在雌雄成虫的虫体、组织和生殖细胞中的响应模式,异源表达后对其体外分子伴侣活性进行测定,最后通过RNA干扰实验验证HSP基因在松墨天牛热胁迫响应中的功能。主要研究结果和结论如下:1.高温胁迫处理条件下测定成虫的存活、取食、繁殖和子代适合度指标,对其耐热性进行评估。设置连续高温胁迫处理,测定松墨天牛雌雄成虫在37.5、40、42.5和45℃条件下的致死中时间。设置每天3 h的周期重复性热胁迫处理,发现37.5℃周期重复性热胁迫对成虫的存活情况、取食量、产卵量与子代适合度等参数未产生显著影响。当胁迫温度提高至40和42.5℃时,雌雄成虫寿命缩短、取食量和产卵量降低及子代适合度下降。但仍有部分个体可继续延续种群,并且成虫出现了热适应性及产卵策略的改变。研究结果可知,松墨天牛成虫的耐热性较强,夏季常见的37.5℃高温天气不会对其种群动态产生影响,随着全球气候变暖加剧,40℃及以上的高温频率增加,仍有部分个体可成功存活及繁殖。2.利用RACE和RT-PCR扩增技术,克隆获得了13条MaltHSP20s基因、2条MaltHSP40s基因和6条MaltHSP70s基因。通过生物信息学预测HSPs的结构特点,发现这些基因的开放阅读框长度、蛋白相对分子质量、结构域、序列标签、二级结构和三维结构均符合所属家族的特征。亚细胞定位预测显示松墨天牛热激蛋白基因广泛分布于胞外、细胞核、细胞质、线粒体与内质网等部位。对来自不同类群昆虫的HSP20、HSP40和HSP70基因分别构建系统发育树,显示松墨天牛的HSP基因均聚类在鞘翅目分支上,且与光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）的HSP基因亲缘关系最近,表明松墨天牛热激蛋白基因序列的结构较为保守。3.通过荧光定量PCR检测了21条HSP基因在雌雄成虫在短时高温胁迫下的转录响应,结果表明:HSP基因的相对表达量在35℃的处理下开始上调,随胁迫温度的升高在42.5℃条件下达到峰值;热胁迫下,MaltHSP20-5、MaltHSP20-11、MaltHSP70-2这3条基因在雌雄成虫中的上调倍数最高;辅助分子伴侣MaltHSP40s和保守型Malt HSC70s的上调倍数较低;大多数HSP基因在卵巢和精巢中相对表达量最高,其次是触角、足和翅等组织,热激后HSP基因在头部上调倍数很高。筛选MaltHSP20-5、MaltHSP20-11及MaltHSP70-2为松墨天牛成虫热胁迫响应的关键基因,推测其优先保护生殖相关蛋白质。4.通过体外原核表达纯化成功获得了高浓度的MaltHSP20-5、MaltHSP20-11及MaltHSP70-2蛋白。体外分子伴侣活性验证实验表明MaltHSP20-5和MaltHSP20-11可有效保护苹果酸脱氢酶、柠檬酸合酶在43℃下的热聚集,且与底物摩尔浓度比例为1:1时保护效果较好,MaltHSP20-5的分子伴侣活性显著优于MaltHSP20-11。MaltHSP70-2在25至40℃温度区间内具备较高且稳定的ATP酶活力,过表达MaltHSP70-2的大肠杆菌细胞耐热性显著提高。说明松墨天牛HSP具备较高的分子伴侣活性,可在热胁迫下对松墨天牛体内蛋白质进行保护并提高细胞耐热性,从而帮助机体抵御热胁迫。5.通过蛋白免疫印记实验对松墨天牛热激蛋白在翻译水平上的表达特性进行检测。发现热胁迫后MaltHSP20-5、MaltHSP20-11及MaltHSP70-2蛋白在雌雄成虫及卵巢和精巢叶中大量上调。利用免疫荧光染色对热激蛋白在松墨天牛精巢叶中的分布进行检测,表明MaltHSP20-5和MaltHSP70-2均主要分布于初级精母细胞的细胞质中,并且热胁迫后平均荧光强度显著提高,而在精细胞中分布较少且无显著差异;热激后MaltHSP20-5蛋白在初级精母细胞的细胞核中有分布。从翻译水平上验证了HSP参与松墨天牛的热胁迫响应及其对生殖细胞的保护。6.利用RNA干扰技术探究降低MaltHSP20-5和MaltHSP70-2基因在松墨天牛体内的表达量对成虫耐热性及其他HSP基因表达量的影响,发现注射8μg MaltHSP20-5和MaltHSP70-2基因片段的双链RNA后,3～5d内检测到靶标基因的下调。MaltHSP20-5和MaltHSP70-2基因下调使松墨天牛雌雄成虫在42.5℃下的致死中时间缩短及存活率降低。同时,MaltHSP20-5基因下调后,MaltHSP40-1和MaltHSP70-2的表达量下调;MaltHSP70-2下调后,MaltHSP20-5和MaltHSP40-1的表达量上调。说明热激蛋白各家族之间存在互作关系,进一步验证了热激蛋白基因参与松墨天牛的热胁迫响应。