【摘 要】
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紫花苜蓿素有“牧草之王”的称呼,是我国畜牧业发展所需粗蛋白的重要来源,低温是影响紫花苜蓿生长导致产量下降的主要逆境之一。黄花苜蓿(Medicago falcata L.)是一种非常耐
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紫花苜蓿素有“牧草之王”的称呼,是我国畜牧业发展所需粗蛋白的重要来源,低温是影响紫花苜蓿生长导致产量下降的主要逆境之一。黄花苜蓿(Medicago falcata L.)是一种非常耐寒、耐旱的豆科牧草,是苜蓿抗性育种的重要基因库,从中挖掘抗寒相关基因对于培育紫花苜蓿抗寒新品种十分重要。本文对响应低温的Mf WAK和MsLRPK基因的功能进行分析,主要研究结果如下:通过农杆菌介导的方法将过表达Mf WAK基因的载体转化截形苜蓿,获得转基因植株,经过PCR检测,获得5株阳性植株,通过实时荧光定量PCR检测Mf WAK基因的表达量,结果显示转基因植株编号A35-8、A14、A41、A1-4、A17中Mf WAK基因得到较高水平的表达,不同株系间的表达量存在差异,株系编号A1-4的Mf WAK基因表达量最高。对转基因植株的抗寒性进行了检测,结果显示野生型的半致死温度为-2℃左右,转基因植株的半致死温度在-3℃到-6℃之间,与野生型的差异显著。转基因植株中A1-4半致死温度最低(为-6℃),A17半致死温度最高(为-3℃)。结果表明表达Mf WAK基因能提高截形苜蓿抗寒性。本实验室前期研究中,发现了一个黄花苜蓿中Mf LRPK的表达受低温抑制,而截形苜蓿中该基因的表达受低温诱导。本文从紫花苜蓿克隆了同源MsLRPK基因的cDNA的全长,O RF全长2173bp,其中GC含量为41.79%,其编码的蛋白由723个氨基酸组成,属于跨膜蛋白,胞外为富含亮氨酸的重复序列,胞内为蛋白激酶区。采用荧光定量PCR技术分析了紫花苜蓿MsLRPK基因对低温的响应,结果显示MsLRPK基因在低温处理2h后开始受到诱导,24h时表达量达到最大。进一步采用CRISPR/Cas9系统,对MsLRPKK基因进行基因组编辑,获得了转基因紫花苜蓿植株。经过PCR检测,获得了42株阳性转基因植株。PCR产物直接测序检测靶点突变情况,获得3个靶点2突变的转基因植株68-1、76-2、19-2。对野生型和突变型紫花苜蓿测定相对电导率,结果显示在-8℃处理1h后,靶点2突变植株的电导率显著低于野生型,表明MsLRPK基因突变提高了紫花苜蓿的抗寒性。
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