论文部分内容阅读
目的了解育龄夫妇睡眠和昼夜节律紊乱现况,探讨睡眠行为和昼夜节律紊乱对育龄夫妇不孕不育的影响;进一步明确睡眠行为和昼夜节律紊乱与女性不同类型和不同病因不孕及男性精液质量的关联,并阐明DNA甲基化在育龄女性睡眠问题与不孕之间的中介作用。方法本研究共分为三个部分。第一部分:依托育龄夫妇生殖健康-安徽队列（RHCC-AC）子队列新婚夫妇队列开展,招募夫妇共33 483对。通过微信公众号电子问卷,调查育龄夫妇人口统计学指标、睡眠状况和饮食行为等,同时收取生物样本（静脉血和中段尿）。每6个月对基线纳入的夫妇进行1次随访,随访观察至研究对象生育或不孕不育。根据纳入排除标准,最终纳入30 729对育龄夫妇进行睡眠现况分析,对入睡困难等定性资料进行人数（构成比）描述,对BMI等定量资料进行均数±标准差（±s）描述;夫妻之间睡眠特征的比较采用χ~2检验。为探讨育龄夫妇睡眠行为和昼夜节律紊乱对不孕不育有无影响,建立1:1巢式病例对照研究,最终纳入407对育龄夫妇。首先,采用条件Logistic回归分别探讨育龄夫妇总人群、妻子和丈夫睡眠问题对不孕不育的影响。其次,通过广义估计方程（GEE）构建主-客体互依模型（APIM）检验育龄夫妇双方睡眠问题对不孕不育的影响。最后,采用结构方程模型（SEM）路径分析进一步验证夫妇睡眠问题对不孕不育的影响。第二部分:依托RHCC-AC子队列不孕不育专病队列及新婚夫妇队列开展,不孕不育专病队列招募在生殖中心就诊的不孕不育夫妇,完成电子问卷调查后采集生物样本,每6个月随访1次研究对象妊娠情况及新生儿情况等。采用1:1病例对照研究设计,进一步明确睡眠行为和昼夜节律紊乱对女性不孕和男性精液质量的影响,以不孕不育专病队列非先天性因素导致不孕的345名女性和精液异常的172名男性作为病例,以新婚夫妇队列第2次随访已生育健康后代的夫妇作为对照。夫妻基本特征和睡眠特征与不孕不育的关联采用χ~2检验进行两组间差异性比较,采用效应量φ值来比较各睡眠指标对不孕不育影响的大小,还利用条件Logistic回归分析睡眠特征对女性不孕和男性精液质量的影响。第三部分:依托RHCC-AC研究的2个子队列开展,建立1:1病例对照研究,以不孕不育专病队列中排卵障碍不孕女性为病例,以新婚夫妇队列中正常生育的女性为对照,最终共纳入43对女性。提取全血中的DNA,利用850 K甲基化芯片检测全基因组DNA甲基化水平。采用χ~2检验和条件Logistic回归探讨女性睡眠特征对不孕的影响。使用Ch AMP程序包的DMP函数进行病例和对照样本间单个探针位点的显著性检验,利用Bumphunter算法进行差异甲基化Cp G区域分析,并应用曼哈顿图等对差异甲基化位点进行可视化分析。对差异基因进行GO功能和KEGG通路富集分析,并绘图展示最显著富集的结果。采用因果中介分析方法探索DNA甲基化在育龄女性睡眠问题与排卵障碍不孕之间的中介效应。结果第一部分:在纳入的61 458名育龄夫妇中,18.2%的育龄夫妇报告经常打呼噜,丈夫和妻子报告率分别为28.9%和7.4%,丈夫打呼噜报告率显著高于妻子,差异有统计学意义（χ~2=7790.06,P<0.01）;32.2%的育龄夫妇有过度日间嗜睡,丈夫和妻子报告率分别为27.7%和36.6%,妻子日间嗜睡报告率显著高于丈夫,差异有统计学意义（χ~2=559.63,P<0.01）;6.8%的育龄夫妇具有昼夜节律紊乱症状;11.2%的育龄夫妇睡眠问题得分≥4分。相关分析显示丈夫睡眠特征与妻子睡眠特征呈正相关。条件Logistic回归分析显示妻子平均睡眠中点延迟（OR=2.25,P<0.01）、不午睡（OR=1.39,P<0.05）和睡眠问题得分≥4（OR=2.00,P<0.05）是夫妇不孕不育的危险因素;丈夫工作类型为固定夜班或轮班（OR=1.65,P<0.05）及休息日睡眠时间为7～8 h（OR=1.57,P<0.05）是夫妇不孕不育的危险因素。GEE构建APIM模型进行夫妇成对分析,结果显示妻子平均睡眠中点延迟（OR=2.29,P<0.01）是夫妇不孕不育的危险因素;丈夫工作类型为固定夜班或轮班（OR=1.75,P<0.05）和休息日睡眠时间为7～8 h（OR=1.62,P<0.05）是夫妇不孕不育的危险因素。第二部分:条件Logistic回归分析结果显示育龄女性工作日睡眠时间≥8 h（OR=8.23,P<0.01）、休息日睡眠时间≥9 h（OR=3.39,P<0.01）、平均睡眠时间≥8 h（OR=6.06,P<0.01）、社会时差大（OR=2.29,P<0.05）、入睡困难（OR=4.15,P<0.01）和昼夜节律紊乱（OR=3.34,P<0.05）是女性不孕的危险因素。育龄男性工作日睡眠时间<7 h（OR=2.46,P<0.01）、工作日睡眠时间为7～8 h（OR=2.06,P<0.05）、平均睡眠时间<7 h（OR=2.36,P<0.05）和平均睡眠时间为7～8 h（OR=2.02,P<0.05）是男性精液质量异常的危险因素。第三部分:采用DNA甲基化850 K芯片筛选出与女性不孕存在统计学关联的共763个Cp G甲基化位点,分布在476个基因上;共60个基因区域甲基化水平组间差异具有统计学意义。GO和KEGG通路富集分析发现,不孕相关基因主要涉及神经元发育、激素分泌和昼夜节律调节等344个生物过程,主要涉及神经元细胞体和质膜蛋白质等62个细胞组分,主要涉及磷脂酰肌醇结合和神经递质转运蛋白活性等69个分子功能;还涉及内吞作用和粘着斑等37条通路。此外,因果中介分析发现cg07675898、cg08298632和cg15500907共3个甲基化位点可作为女性入睡困难与不孕之间的中介变量;同时,cg01535674、cg14254882和cg0216771733等33个甲基化位点可作为女性睡眠时长与不孕之间的中介变量。结论1.育龄夫妇睡眠问题普遍存在,夫妻之间睡眠特征具有其独特性,同时也具有互依性。妻子睡眠中点延迟、不午睡和多个睡眠问题并存是夫妇不孕不育的危险因素。丈夫工作类型为固定夜班或轮班及休息日睡眠时间短是夫妇不孕不育的危险因素。2.育龄女性睡眠时间长、社会时差大、入睡困难和昼夜节律紊乱与不孕存在关联。育龄男性睡眠时间短与精液质量异常有关。不同类型和不同病因不孕女性睡眠特征有其独特性,如女性昼夜节律紊乱仅与不明原因及排卵障碍不孕存在关联。3.不孕女性组与正常生育女性组相比,不仅存在差异甲基化位点,同时还存在差异甲基化区域。不孕相关基因主要涉及神经元发育、激素分泌、昼夜节律调节和神经递质转运蛋白活性等生物过程和分子功能。本研究还发现入睡困难和睡眠时长可能会通过DNA甲基化水平影响女性不孕。