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背景:耳聋是一种常见的感知性障碍疾病。据统计,全世界3.6亿人受到不同程度耳聋的困扰,约1/1000的新生儿为耳聋患儿,遗传性耳聋占一半以上。其中,非综合征型耳聋(NSHL)约占遗传性耳聋的70%。在本课题组的前期研究中,首次在一个中国遗传性耳聋大家系中定位和克隆了一个新的常染色体显性NSHL(DFNA67)相关致病基因OSBPL2,其编码的氧化固醇结合蛋白样蛋白2(oxysterol binding protein like-2 protein)与氧化固醇结合蛋白(Oxysterol binding protein,OSBP)具有较高同源性,属于OSBP相关蛋白(OSBP-related proteins,ORPs)家族成员。ORP家族是一类与氧化固醇具有高度亲和力的受体蛋白,在细胞内的脂质合成、转运及信号转导过程中发挥重要作用。本研究将利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建OSBPL2突变的耳聋巴马小型猪模型,进一步探索OSBPL2突变的致聋机制。目的:采用CRISPR/Cas9技术建立猪胎儿成纤维细胞(PFFs)OSBPL2敲除的细胞系;以OSBPL2敲除的PFFs细胞系作为体细胞核移植的供体,采用体细胞核移植和胚胎移植技术构建OSBPL2基因缺陷的巴马小型猪模型;在模型动物水平验证基因型与表型的相关性,探讨OSBPL2功能缺陷以及合并高脂饮食干预的条件下血脂参数、听力学和内耳形态学的变化规律。方法:(1)人和猪的OSBPL2基因的生物信息学分析:比对人和猪的OSBPL2基因的序列,采用生物信息学方法对猪与人的OSBPL2基因进行共线性和同源性分析;采用Chou-Fasman算法和Swiss Model在线工具预测并分析人与猪OSBPL2蛋白的二级结构和三级结构。(2)OSBPL2敲除PFFs细胞系的构建:设计合成靶向猪OSBPL2基因第5、6外显子的单导向RNA(single guide RNA,sg RNA),构建CRISPR/Cas9打靶质粒,将重组质粒与具有Neo抗性基因的p CMVtd-Tomato质粒共转染入巴马猪胎儿原代PFFs中,使用遗传霉素G418筛选,获得单克隆细胞,以单克隆细胞的基因组为模板,PCR扩增后进行TA克隆,测序验证单克隆细胞的基因型,筛选OSBPL2双等位基因敲除的单克隆细胞系。(3)OSBPL2敲除的巴马小型猪模型的构建:采用体细胞核移植和胚胎移植技术,获得OSBPL2缺陷的巴马猪小型模型,提取小猪耳组织的基因组DNA,PCR扩增后进行TA克隆后测序,鉴定OSBPL2敲除巴马小型猪的基因型,Western blotting检测巴马小型猪组织中OSBPL2蛋白的表达,免疫组化对OSBPL2在巴马小型猪耳蜗组织中的表达进行定位。(4)听力学与内耳形态学分析:听性脑干反应(ABR)定期检测猪的听力阈值变化;耳蜗组织经石蜡包埋、切片,采用HE染色观察耳蜗形态学变化。(5)血脂生化分析:对基因敲除的巴马猪断奶,另购买5头相同月龄野生型巴马猪,正常饲料喂养一月后分敲除组(KO-C:4头)、敲除-高脂组(KO-H:4头)和野生型高脂组(WT-H:5头),分别圈养。定期检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)水平,同时观察主动脉和冠状动脉的动脉粥样硬化斑块的形成。结果:(1)猪与人的OSBPL2基因及其侧翼序列存在高度共线性,二者氨基酸序列一致性达88%,蛋白同源性较高。且两者蛋白二级结构具有近似等量的α螺旋,β折叠以及β转角结构,蛋白三维建模结构相似度高,均含有严格保守的OSBP指纹特征基序“EQVSHHPP”。(2)根据猪的OSBPL2基因序列,设计合成针对OSBPL2第5、6外显子的两对sg RNAs,构建两个打靶质粒,转染巴马猪原代PFFs细胞。经T7EN1酶系统鉴定,剪切效率分别为11.4%(第5外显子)和0%(第6外显子),用靶向第5外显子的质粒筛选冻存的细胞克隆35个,最终鉴定获得双等位基因突变的细胞克隆19个,基因突变效率为54.29%。(3)采用体细胞核移植和胚胎移植技术,共移植受体猪8头(8月龄长白猪),怀孕3头。其中一头在怀孕37天时,剖出37天大的胎猪14只,制备原代PFFs细胞,鉴定其基因型全部为OSBPL2双等位基因敲除;另两头怀孕足月,分别自然生产4头与6头小猪(其中一头四肢与口唇畸形,当天处死取材),鉴定基因型均为双等位基因敲除,且与相应供体的细胞基因型相符;Western blotting检测显示,克隆小猪的脑、肾组织未检测到OSBPL2蛋白的表达。OSBPL2在巴马小型猪的耳蜗中主要表达定位在螺旋神经节、血管纹和基底膜中。(4)出生的克隆猪在断奶一月后定期进行听力学检测。与同月龄的野生型巴马小型猪的听力阈值(40~60 d B SPL)相比,KO-C组与KO-H组小猪均呈现渐进性的听力损失,且KO-H组的听力下降尤为明显(4月龄时,听力阈值均在100 d B SPL以上,表现为重度耳聋)。耳蜗HE染色未发现明显的内耳组织形态学改变。(5)KO-C组与KO-H组的小猪均出现肥胖表型,且血脂参数异常,特别是KO-H组的TC和LDL升高明显;苏丹染色显示KO-H组的胸主动脉和腹主动脉可见明显的斑块,而WT-H组和KO-C组的相应动脉未见明显病变。结论:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建得OSBPL2基因敲除的巴马小猪模型,并表现出血脂参数异常和听力损失双重表型。且高脂饮食干预加速耳聋表型的发生。本研究为进一步探索OSBPL2的功能及其突变致病效应奠定了良好基础,为脂代谢紊乱与听力损失的相关性提供了实验证据,并为遗传性耳聋的预防与诊疗奠定了理论基础。